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Fluoreszenzmikroskopische Studien an Plasmamembranen zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der neuronalen Exocytose

dc.contributor.advisorJahn, Reinhard Prof. Dr.de
dc.contributor.authorZilly, Felipe Emiliode
dc.date.accessioned2012-04-16T14:57:00Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:40Zde
dc.date.issued2006-09-18de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AC75-Cde
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-660
dc.description.abstractBei der regulierten Exocytose in Neuronen und neuroendokrinen Zellen führt ein intrazellulärer Anstieg der Calciumkonzentration zur Core-Komplexbildung zwischen den plasmamembranständigen SNAREs Syntaxin1A und SNAP-25 und dem vesikelassoziierten SNARE Synaptobrevin. Dadurch werden die gegenüberliegenden Membranen fusioniert. Neben den SNAREs ist auch Munc18-1, das zur Sec1/Munc18-Proteinfamilie gehört, ein essentielles Protein der neuronalen Exocytose. Der Munc18-1-Knockout führt zum Block der neuronalen Exocytose. In vitro bildet Munc18-1 mit Syntaxin1 einen Komplex, der Syntaxin1 in einer sogenannten geschlossenen Konformation hält. In diesem Komplex ist Syntaxin1 für Reaktionen mit SNAP-25 und Synaptobrevin2 unzugänglich, so dass keine Core-Komplexbildung mehr stattfinden kann. Wie diese Inhibition der Core-Komplexbildung mit der essentiellen Munc18-1-Funktion zusammenpasst ist bisher nicht verstanden. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass Munc18-1 in intakten und exocytosekompetenten Plasmamembranpräparationen von PC12-Zellen mit membrangebundenem Syntaxin1 einen Komplex bildet. Aus diesem Komplex heraus kann Munc18-1 durch Zugabe von rekombinantem Synaptobrevin2, welches Core-Komplexe mit den endogenen SNAREs bildet, gelöst werden. Wurde das Experiment unter gleichen Bedingungen, jedoch statt unter Zugabe von Synaptobrevin2 unter Zugabe von rekombinantem Syntaxin1A bzw. SNAP-25, die keine Core-Komplexe an der Membran bilden, durchgeführt, verblieb Munc18-1 an Syntaxin1 gebunden. Zur Kontrolle wurde dieses Experiment auch an Membranen von SNAP-25-defizienten Mäusen durchgeführt. Da hier grundsätzlich keine Core-Komplexbildung stattfindet, konnte, wie erwartet, keine Freisetzung von Munc18-1 durch Synaptobrevin2 beobachtet werden. Dies untermauert, dass in der nativen Membran Syntaxin1 trotz seiner Munc18-1-Bindung für die Core-Komplexbildung zur Verfügung steht und dass sich Munc18-1 nach dieser Komplexbildung von Syntaxin1 löst. Daraus wird geschlossen, dass Munc18-1 die Bildung eines Komplexes zwischen Syntaxin1 und SNAP-25 erlaubt, der ein Akzeptor für vesikuläres Synaptobrevin ist und somit ein Intermediat der Exocytose darstellt. Die Munc18-1-Syntaxin-Bindung könnte ein räumlicher und zeitlicher Regulator dieses Intermediates sein und die Bildung unproduktiver SNARE-Komplexe in der Plasmamembran verhindern. Im Rahmen dieser Dissertation wurde außerdem untersucht, ob sich eine Erhöhung der Calciumkonzentration auf den Zustand der SNAREs auswirkt, welche unter Ruhebedingungen unkomplexiert und in Mikrodomänen aufkonzentriert sind. Es konnte gezeigt werden, dass bei erhöhten physiologischen Calcium-Konzentrationen eine starke Abnahme der Antigenizität der SNAREs zu beobachten ist: Für Syntaxin1 war bei gleichzeitiger Abnahme der Antigenizität eine gesteigerte Aufkonzentration in Domänen erkennbar. Für SNAP-25 wurde ein Abfall der Immunreaktivität um 90% beobachtet. Rekombinantes Synaptobrevin2 wurde deutlich schlechter in die Membran eingebaut. Diese Erkenntnisse lassen folgende Interpretationen zu: Durch Calcium kommt es zur Umorganisation von Syntaxin-Domänen. Da das Epitop zur Anfärbung von SNAP-25 innerhalb dessen SNARE-Motivs liegt, könnte die starke Abnahme der Immunreaktivität den Einbau von SNAP-25 in Syntaxin-SNAP-25-Komplexe widerspiegeln. Dies wird dadurch untermauert, dass nach Calciumbehandlung weniger rekombinantes Synaptobrevin mit den endogenen SNAREs reagiert.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isogerde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.htmlde
dc.titleFluoreszenzmikroskopische Studien an Plasmamembranen zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der neuronalen Exocytosede
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedFluorescence Microscopy Studies of Plasma Membranes to Analyse the Molecular Machinery of Neuronal Exocytosisde
dc.contributor.refereeJahn, Reinhard Prof. Dr.de
dc.date.examination2006-07-06de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstractengDuring regulated exocytosis from neurons and neuroendocrine cells a rise in intracellular calcium concentration leads to the formation of the so-called core-complex, between the plasmalemmal SNAREs syntaxin1A, SNAP-25 and the vesicular synaptobrevin2. As a result of this reaction the two opposing membranes are fused. Apart from the SNAREs, the protein Munc18-1, which belongs to the Sec1/Munc18 protein family, is also an essential factor in neuronal exocytosis. The knockout of Munc18-1 leads to the block of neuronal exocytosis. In vitro Munc18-1 forms a complex with syntaxin1, where syntaxin is kept in a closed conformation. In this complex syntaxin1 is not accessible for reactions with SNAP-25 and synaptobrevin2 and thus unable to form core-complexes. How this inhibition of core complex formation fits with the essential function of Munc18-1 is not yet understood. In this work it is shown that Munc18-1 forms a complex with membrane bound syntaxin1 in intact plasma membrane preparations of PC12 cells, which retain exocytic competence. The addition of recombinant synaptobrevin2, which leads to core-complex formation with endogenous SNAREs, breaks this complex. However, in a parallel experiment, recombinant SNAP-25 or syntaxin1A, which do not form core complexes at the plasma membrane, did not affect the Munc18-1-syntaxin1 binding. As a further control this experiment was repeated using membranes from SNAP-25 deficient mice. Here, as an axiom no core-complex formation can occur, and as expected the addition of recombinant synaptobrevin2 did not show a release of Munc18-1. This supports the idea that in native membranes syntaxin1, even if complexed by Munc18-1, is available for core complex formation and that Munc18-1 leaves syntaxin1 after complex formation. From that it is concluded that Munc18-1 binding allows complex formation between syntaxin1 and SNAP-25, which forms an acceptor site for vesicular synaptobrevin and is an intermediate in exocytosis. Munc18-1-syntaxin binding could be a spatial and temporal regulator of this acceptor complex, hereby preventing unproductive SNARE-complex formation in the plasma membrane. A further line of investigation was to see if the rise of the calcium concentration affects the state of the SNAREs in the plasma membrane. In the resting state these are uncomplexed and concentrated in protein microdomains. It could be shown that after a rise in physiological calcium concentration the immunostaining intensity of SNAREs decreases. Furthermore, for syntaxin1 concentration of syntaxin in visible microdomains increased, concomitant with the loss of some microdomains in the membrane. For SNAP-25 a 90% decrease in immunostaining intensity was observed. Less recombinant synaptobrevin2 was incorporated into the plasma membrane. This observations let us conclude: Calcium induces a reorganisation of syntaxin1 domains. As the epitope for SNAP-25 immunostaining resides within the SNARE-motif of this protein, the loss of immunostaining intensity could reflect the incorporation of SNAP-25 in complexes with endogenous syntaxin1. This would be supported by the observation that upon treatment with calcium less recombinant synaptobrevin2 reacts with endogenous SNARES.de
dc.contributor.coRefereeHardeland, Rüdiger Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerSNAREde
dc.subject.gerSyntaxinde
dc.subject.gerMunc18de
dc.subject.gerExocytosede
dc.subject.gerPC12de
dc.subject.engSNAREde
dc.subject.engsyntaxinde
dc.subject.engMunc18de
dc.subject.engexocytosisde
dc.subject.engPC12de
dc.subject.bk35.70de
dc.subject.bk42.13de
dc.subject.bk42.15de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-928-5de
dc.identifier.purlwebdoc-928de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWHC 100: Zellmembranen, Zelloberfläche, Zellwand, intrazelluläre Membranen {Cytologie}de
dc.subject.gokfullWHF 800: Permeabilität, inter- und intrazellulärer Transport {Cytologie}de
dc.identifier.ppn517917025de


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