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Experiments to improve the quality of sex-sorted fresh and frozen porcine spermatozoa

dc.contributor.advisorRath, Detlef Prof. Dr.de
dc.contributor.authorGroßfeld, Rudolfde
dc.date.accessioned2007-07-10T14:39:00Zde
dc.date.accessioned2013-01-18T10:08:53Zde
dc.date.available2013-01-30T23:51:16Zde
dc.date.issued2007-07-10de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AFFB-Ede
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-1691
dc.description.abstractExperimente zur Verbesserung der Qualität von gesextem und tiefgefrorenem EberspermaAus verschiedenen Gründen gibt es einen Bedarf für gesextes Ebersperma. Einige dieser Gründe sind Vorteile im Herdenmanagement, verbesserte Produktionseffizienz, Restriktionen bei der Kastration männlicher Tiere und Programme zur Genpräservation. Aufgrund der hohen Kosten für den Sortierprozess und der geringen Lagerdauer in Flüssig konserviertem Zustand, würde das Tiefgefrieren von gesextem Sperma große Vorteile bringen, wenn die Spermaqualität nach dem Auftauen akzeptabel wäre. Daher war das Ziel dieser Studie existierende Tiefgefriermethoden für Schweinesperma an die Verarbeitung von flowzytometrisch gesextem Sperma anzupassen. In zwei Abschnitten wurden fünf Versuche durchgeführt, um die Qualität von tiefgefrorenem und gesextem Sperma zu verbessern. Im ersten Abschnitt wurde zunächst der Zusatz von Na-Pyruvat, Catalase und Mercaptoethanol und des Vitamin E-Analogs Trolox zum Kühl- und Gefrierverdünner von Ebersperma getestet. Die tiefgefrorenen und aufgetauten Spermien wurden bis zu sechs Stunden nach dem Auftauen inkubiert und die Motilität, der morphologische Status und die Membranintegrität und der Akrosomstatus wurden mittels Färbung mit SYTO-17/FITC-PNA/PI im Flowzytometer getestet. In einem zweiten Versuch wurde der Einfluss von individuellen Einfrierkurven für vier Eber getestet. Die tiefgefrorenen und aufgetauten Spermien wurden bei 38°C für bis zu sechs Stunden nach dem Auftauen inkubiert und die Motiliät, der morphologische Status wurde ebenso erfasst. Ebenso wurde die Membranintegrität und der Akrosomstatus mittels Färbung mit SYTO-17/FITC-PNA/PI im Flowzytometer getestet. Im zweiten Abschnitt wurde der Zusatz von Na-Pyruvat, Catalase und Mercaptoethanol zu flüssig konserviertem frischem und gesextem Sperma und zum Kühl- und Gefrierverdünner für die Spermatiefgefrierung getestet. Ebenso wurde getestet, ob gesexte und tiefgefrorene Eberspermien für die chirurgische Besamung in die Uterushornspitze genutzt werden können. Zunächst wurden frische oder gesexte Eberspermien bis zu fünf Tage mit oder ohne Zusatz von Pyruvat, Catalase und Mercaptoethanol zum Konservierungsmedium gelagert. Nach Lagerung für 0 Std., 24 Std. oder 120 Std. wurden Proben entnommen und für bis zu zwei Stunden bei 38°C gelagert. Die Motilität und der morphologische Status nach 120 Std. wurden erfasst. In einem folgenden Versuch wurden zwei verschiedenen Konzentrationen der Antioxidantien zum Kühl- und Gefrierverdünner und zwei verschiedene Spermakonzentrationen von ungesextem und gesextem Ebersperma getestet. Die Motilität im Thermoresistenztest und der morphologische Status wurden erfasst. Ebenso wurden die Membranintegrität und der Akrosomstatus mittels Färbung mit SYTO-17/FITC-PNA/PI im Flowzytometer nach 0 Std., 3 Std. und 6 Std. nach dem Auftauen getestet. Zuletzt wurden sechs Jungsauen chirurgisch mit vier Millionen gesexten und unter Zusatz von Antioxidantien tiefgefrorenen Eberspermien in die Eileiterampulle besamt. Die Jungsauen wurden 48 Std. später geschlachtet und die Embryonen wurden aus dem Genitaltrakt zurückgespült. Die folgenden Ergebnisse lassen sich zusammenfassen: Im ersten Abschnitt zeigte das Vorhandensein von Na-Pyruvat, Catalase und Mercaptoethanol zum Kühl- und Gefrierverdünner eine signifikant (P≤0,05) verbesserte Spermienmotilität direkt nach dem Auftauen verglichen mit Sperma, das ohne jegliche Zusätze eingefroren wurde. Der Prozentsatz von Spermien mit normalem apikalem Rand und gesamter morphologisch veränderter Spermien unterschied sich nicht zwischen Gruppen. Ebenso zeigte die flowzytometrische Analyse der Membranintegrität und des Akrosomstatus keine signifikanten Unterschiede. Allerdings sank der Prozentsatz von lebenden Spermien und stieg der Prozentanteil von Akrosom reagierten Spermien signifikant (P≤0,05) innerhalb von elf von 12 Behandlungsgruppen im Zeitverlauf an. Nach der Analyse von drei verschiedenen Einfrierkurven für die vier Eber konnten signifikante (P≤0,05) Unterschiede zwischen den Einfrierkurven nur bei einem Eber festgestellt werden. Die Spermien dieses Ebers zeigten eine höhere Motilität nach dem Auftauen, nachdem sie mit einer kurzen, anstatt einer langen Einfrierkurve tiefgefroren wurden. Die Auswertung des morphologischen Status der Spermien zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den jeweiligen Einfrierkurven. Die Analyse der Spermien im Flowzytometer zeigten einen niedrigeren Anteil viabiler und Akrosom reagierter Spermien und einen signifikant (P≤0,05) niedrigeren Anteil Membran geschädigter und Akrosom reagierter Spermien bei einem Eber dessen Spermien mit einer mittleren Einfrierkurve, anstatt der kurzen oder langen Kurve eingefroren wurden. Signifikante (P≤0,05) Unterschiede wurden in Teilen der Versuchsgruppen bei allen Ebern gefunden, wo der Prozentanteil viabiler Spermien absank und der Prozentanteil Akrosom reagierter Spermien anstieg, jeweils nach zweistündiger Inkubation bei 38°C. Im zweiten Abschnitt sank die Motilität von frischen ungesexten und gesexten Eberspermien während der Lagerung bei 15°C und bei der Inkubation bei 38°C in allen Behandlungsgruppen ab. Die Spermamotilität war höher in den ungesexten, als in den gesexten Versuchsgruppen, allerdings war dieser Unterschied nur statistisch signifikant (P≤0,05) nach einer Lagerdauer von 120 Std. bei 15°C und 15 Minuten Inkubation bei 38°C. Der Zusatz von Pyruvat, Catalase und Mercaptoethanol zeigte einen leichten positiven Effekt auf die Motilität bei den gesexten Spermien, aber die Differenz war nicht signifikant. Der Anteil von Akrosom geschädigten Spermien nach morphologischer Analyse war in den gesexten Versuchsgruppen signifikant (P≤0,05) höher als in den ungesexten Versuchsgruppen, unterschied sich aber nicht zwischen Gruppen mit oder ohne Zusatz von Pyruvat, Catalase und Mercaptoethanol. Im folgenden Experiment direkt nach dem Auftauen zeigten nur gesexte Spermien, die bei einer Spermakonzentration von 80 Mio. Spermien pro ml ohne Zusätze eingefroren wurden, eine signifikant (P≤0,05) niedrigere Motilität als alle anderen Versuchsgruppen. Zwischen allen anderen Gruppen bestanden keine signifikanten Unterschiede. Die ungesexten Versuchsgruppen zeigten eine höhere Motilität als die gesexten Versuchsgruppen. Dieser Unterschied war aber von einer Stunde bis sechs Stunden nach dem Auftauen nicht signifikant. Bei der morphologischen Beurteilung der Spermien konnten ebenfalls keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Direkt nach dem Auftauen zeigte die Gruppe unsortierter, mit einer Konzentration von 40 Mio. Spermien pro ml und ohne Zusätze eingefrorene Gruppe einen signifikant (P≤0,05) höheren Prozentsatz von viabilen Spermien mit intakten Akrosomen als gesexte Spermien, mit Zusatz von Pyruvat, Catalase und Mercaptoethanol, die bei einer Konzentration von 80 Mio. Spermien pro ml eingefroren wurden. Nach einer Inkubation von einer Stunde und mehr konnten keine signifikanten Unterschiede mehr festgestellt werden. In allen Versuchsgruppen sank der Anteil viabiler und Akrosom intakter Spermien signifikant (P≤0,05) während der Inkubation ab. Im letzten Versuch konnte nachgewiesen werden, dass gesexte Eberspermien, die mittels Zusatz von Pyruvat, Catalase und Mercaptoethanol tiefgefroren wurden erfolgreich Oozyten nach chirurgischer Besamung in vivo befruchten können. Von sechs Jungsauen konnten 70 Embryonen zurückgespült werden. Von diesen Embryonen waren 52,5% befruchtet und 27,1% entwickelten sich zu Blastozysten-Stadien. Zusammengefasst hat der Zusatz von Pyruvat und der Antioxidantien Catalase und Mercaptoethanol zu Verdünnermedien nur einen geringen Effekt auf frische, gesexte oder tiefgefrorenen Eberspermien. Der Zusatz kann die Motilität der Spermien verbessern, hat aber nur einen geringen oder keinen Effekt auf die Spermienmorphologie. Der Zusatz von Pyruvat, Catalase und Mercaptoethanol verbesserte die Qualität von gesextem und flüssig konserviertem oder tiefgefrorenem Sperma nicht signifikant. Möglicherweise gibt es andere Schädigungen beim Spermasexing, die nicht durch den Zusatz von Pyruvat, Catalase und Mercaptoethanol verhindert werden können.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.htmlde
dc.titleExperiments to improve the quality of sex-sorted fresh and frozen porcine spermatozoade
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedExperimente zur Verbesserung der Qualität von gesextem und tiefgefrorenem Eberspermade
dc.contributor.refereeHoltz, Wolfgang Prof. Dr.de
dc.date.examination2007-05-16de
dc.subject.dnb630 Landwirtschaftde
dc.subject.dnbVeterinärmedizinde
dc.description.abstractengExperiments to improve the quality of sex-sorted fresh and frozen porcine spermatozoaFor several reasons the demand for sex sorted porcine spermatozoa has been expressed. This includes advantages for herd management, improved production efficiency, foreseeable restrictions of male castration and gene preservation programmes. Due to the high costs for the sex-sorting process and the reduced storage time in liquid state, freezing of sex-sorted spermatozoa in liquid nitrogen would be very advantageous if the post thawing sperm quality would be acceptable. Therefore, the ultimate goal of the present study was to adapt existing freezing methods for porcine spermatozoa to the post sort processing of sexed spermatozoa. In two chapters five trials were conducted, in order to improve the quality of frozen- and sex-sorted spermatozoa. In presence of Sodium Pyruvate, the addition of the ROS scavengers Catalase and Mercaptoethanol, and the Vitamin E analogue Trolox to cooling and freezing media of boar semen was tested. Frozen spermatozoa were incubated for up to six hours after thawing and motility, morphological status, membrane integrity, and acrosomal status via triple staining in a flow cytometer (SYTO-17/FITC-PNA/PI) were recorded. In a second trial the influence of individual freezing curves for four boars were tested. Frozen spermatozoa were incubated at 38°C for up to six hours after thawing and motility as well as the morphological status were recorded. Also membrane integrity and acrosome status via triple staining in a flowcytometer (SYTO-17/FITC-PNA/PI) were recorded 0 and 2 hours after thawing. In the second chapter the addition of Pyruvate, Catalase and Mercaptoethanol to media for fresh semen preservation and to cooling and freezing media for cryopreservation were tested. It was also tested if sex-sorted and frozen-thawed porcine spermatozoa can be used for surgical insemination into the tip of the uterine horn. Initially fresh and sex-sorted semen were stored for up to five days with or without the addition of Pyruvate, Catalase and Mercaptoethanol to the storage media. Semen samples were put in a thermo resistance test at 38°C for two hours after storage at 15°C for 0, 24 and 120 hours and the motility as well as the morphological status after 120 hours were recorded. In a subsequent trial two different concentrations of Pyruvate, Catalase and Mercaptoethanol were added to cooling and freezing media in two different sperm concentrations (40 and 80 x 106 sperm per ml), and motility as well as the morphological status were recorded in a thermo resistance test. Also the membrane integrity and acrosome status were recorded employing a flow cytometrical analysis with a triple staining protocol (SYTO-17/FITC-PNA/PI) 0, 3 and 6 hours after thawing. Finally, six gilts were inseminated surgically into the ampoule of the oviduct with four million sex-sorted spermatozoa frozen and thawed with addition of Pyruvate, Catalase and Mercaptoethanol. Gilts were slaughtered 48 hours later and the embryos were reflushed from the genital tract. In summary the following results were obtained. Directly after thawing fresh spermatozoa frozen in the presence of antioxidants showed a significantly (P≤0.05) improved motility compared to spermatozoa frozen without additives. The percentage of normal apical ridges and the gross morphology did not differ significantly between the treatment groups. After flow cytometrical analysis of membrane integrity and acrosome status no significant differences could be detected among treatment groups, but the percentage of viable spermatozoa decreased and the percentage of acrosome damaged spermatozoa increased in eleven of twelve sperm subgroups within one respective treatment group during incubation time. After the evaluation of different freezing curves for individual animals significant differences could only be detected for one boar directly after thawing. The spermatozoa of this boar showed a higher (P≤0.05) motility after being frozen with a short, instead with a long freezing curve. The analysis of the morphological status showed no significant differences in all boars between the different freezing curves. The evaluation of the viability and acrosome reaction showed that the percentage of viable, acrosome reacted spermatozoa and the percentage of membrane damaged and acrosome reacted spermatozoa of one boar were significantly lower in the sample frozen following the medium timed protocol than following the short and long protocol. Significant differences were also recorded in part of the treatment groups of all boars, were the percentage of viable spermatozoa decreased and the percentage of acrosomal damages increased after two hours of incubation at 38°C. Motility of fresh non-sorted and sex-sorted sperm samples decreased during storage at 15°C as well as during incubation at 38°C in all treatment groups. The sperm motility was higher in the non-sorted groups than in the sex-sorted groups, although the difference was only statistically significant (P≤0.05) after 120h storage at 15°C and 15min incubation at 38°C. The addition of antioxidants had a slightly beneficial effect on the motility of sex-sorted spermatozoa, but the difference was not statistically significant. The percentage of acrosomal damaged spermatozoa was significantly (P≤0.05) higher in the sex-sorted spermatozoa than in the fresh semen samples, but did not differ between the samples stored with or without additives.In the subsequent experiment 0h after thawing only the sex-sorted samples frozen and thawed in sperm concentration of 80 x 106/ml without addition of Pyruvate, Catalase and Mercaptoethanol showed a significant (P≤0.05) lower motility than all other groups. All other groups showed no significant differences. However, the non-sorted semen samples showed an elevated motility when compared with sex-sorted samples, but from 1h after thawing up until 6h no statistically significant differences could be measured in the sperm motility between all treatment groups. No significant differences in the morphological status of the spermatozoa could be detected between all treatment groups. Directly after thawing the non-sorted sperm frozen without antioxidants showed a significantly (P≤0.05) higher portion of viable sperm with intact acrosomes than the sex-sorted samples frozen without additives and 80 x 106 sperm per ml. Further incubation did not reveal significant differences in acrosomes. In all treatment groups the percentage of vital and acrosome intact spermatozoa decreased significantly during incubation for six hours. The last trial proved that sex-sorted porcine spermatozoa frozen with antioxidants and Pyruvate can successfully be used to fertilize oocytes in vivo after surgical insemination. From six gilts 70 embryos were reflushed. From these embryos 52.5% were fertilized and 27.1% developed to blastocysts stages. From these results it can be concluded that the addition of Pyruvate, and the antioxidants Catalase and Mercaptoethanol have only limited effect on motility of fresh, sex-sorted and frozen porcine spermatozoa and almost no effect on sperm morphology. Antioxidants did not significantly improve the quality of sex-sorted semen after either fresh or frozen storage. There may be other damages during flowcytometrical sorting that can not be prevented by the addition of the ROS scavengers.de
dc.contributor.coRefereeRath, Detlef Prof. Dr.de
dc.subject.topicAgricultural Sciencesde
dc.subject.gerKünstliche Besamungde
dc.subject.gerSpermatozoade
dc.subject.gerSperma Sexingde
dc.subject.gerAntioxidantiende
dc.subject.gerFlowzytometriede
dc.subject.gerKryokonservierungde
dc.subject.engartificial inseminationde
dc.subject.engspermatozoade
dc.subject.engsperm sexingde
dc.subject.engantioxidantsde
dc.subject.engflowcytometryde
dc.subject.engcryopreservationde
dc.subject.bk46.60 Fortpflanzungde
dc.subject.bkEntwicklungde
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1517-1de
dc.identifier.purlwebdoc-1517de
dc.affiliation.instituteFakultät für Agrarwissenschaftende
dc.subject.gokfullYNR 000 Embryotransferde
dc.subject.gokfullGynäkologiede
dc.subject.gokfullkünstliche Besamungde
dc.subject.gokfullveterinäre Geburtshilfede
dc.identifier.ppn573777314de


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