Visualization of synaptic vesicle protein recycling during exo-endocytosis at individual hippocampal boutons

Abstract

Während der Exozytose werden synaptische Vesikelproteine in die Plasmamembran freigesetzt und müssen durch kompensatorische Endozytose wieder zurückgewonnen werden. Wenn man GFP-markierte Varianten der Vesikelproteine Synaptobrevin 2 / VAMP 2 und Synaptotagmin 1 in Neuronen überexprimiert, befinden sich davon unter Ruhebedingungen bis zu 30% auf den axonalen Außenmembranen. Um zu testen, ob und zu welchem Außmaß diese in der Plasmamembran gestrandeten Proteine am exo-endozytotischen Zyklieren teilnehmen, wurde ein neuartiger proteolytischer Ansatz angewendet, der es erlaubt deren Schicksal visuell von dem der Proteine zu unterscheiden, die bei der Fusion neu hinzugefügt werden. Die gewonnenen Daten deuten darauf hin, dass sich beide Pools rasch durch Diffusion vermischen und dass endozytierte Vesikel größtenteils aus vorherig gestrandeten Proteinen zusammengesetzt sind. Das Ausmaß an Nicht-Identität exo- und endozytierter vesikulärer Proteine ist von der Stimulationsdauer abhängig. Durch Coexpression von Synaptophysin 1 und durch den Einsatz eines Antikörpers gegen die externe luminale Domäne Synaptotagmins 1 konnte geschätzt werden, dass sich unter physiologischen Bedingungen etwa 10% der vesikulären Proteine nah an der aktiven Zone befinden, wovon diese präferenziell wiederaufgenommen werden, sobald die Stimulation einsetzt. Diese Befunde legen nahe, dass der sofort-freisetzbare-Pool an Vesikeln auf der endozytotischen Seite des Zyklus durch einen sofort-aufnahmebereiten-Pool an teilweise vorassemblierten Vertiefungen ausgeglichen sein könnte, aus dem sich schnell neue Vesikel bilden können, so daß die Aufrechterhaltung des rezyklierenden Vesikel-Pools unter normalen Stimulationsbedingungen gewährleistet ist.Zweitens wurde in Kollaboration mit dem Labor Prof. Dr. Volker Hauckes (Institut für Chemie und Biochemie, Freie-Universität-Berlin) der Zusammenhang zwischen der Funktion des Stonin 2-Proteins in Clathrin-vermittelter Endozytose und Synaptotagmin1-Rückgewinnung untersucht. Obwohl Clathrin-vermittelte Endozytose ein Hauptweg des präsynaptischen Vesikel-Zyklierens zu sein scheint, konnte in Säugetieren bisher kein Sortierungsadapter identifiziert werden, der der Endozytose synaptischer Vesikelmembran-Proteine zugeordnet ist. Gemeinsam konnten wir aufzeigen, dass Stonin 2 ein AP-2-abhängiger Sortierungsadapter für die endozytotische Internalisierung und Rückgewinnung von Synaptotagmin 1 in Neuronen ist.