Kristallstrukturen der C2B-Domäne von Rabphilin-3A und der PP2C-ähnlichen Phosphatase tPphA von Thermosynechococcus elongatus BP-1

Abstract

Die vorliegende Arbeit befaßt sich im ersten Teil mit der Röntgenkristallstruktur der C2B-Domäne von Rabphilin-3A , die auch einen Teil der linker-Region zwischen der C2A- und der C2B-Domäne des Rabphilin-3A enthält, und im zweiten Teil mit der Röntgenkristallstruktur der PP2C-ähnlichen Phosphatase tPphA von Thermosynechococcus elongatus BP-1. Beide Strukturen konnten nach Expression, Reinigung und Kristallisation des nativen und Se-Met Proteins mittels MAD (multiple-wavelength anomalous dispersion) gelöst werden. In beiden Fällen wurden Kristalle in zwei verschiedenen Raumgruppen erhalten, die jeweils miteinander verglichen wurden.C2-Domänen sind intrazelluläre, ca. 130 Aminosäuren umfassende Proteinmodule, welche als charakteristisches Strukturmerkmal ein achtsträngiges, antiparalleles β-Sandwich aufweisen und zumeist eine hohe Kalziumionen-Affinität zeigen. Sie sind sowohl an der Exocytose, als auch an der Regulierung der Neurotransmitterfreisetzung im synaptischen Vesikelzyklus beteiligt. Rabphilin-3A enthält sowohl eine Rab-Bindungsdomäne, als auch zwei C2-Domänen (C2A und C2B). Die NMR-Struktur der C2B-Domäne war bekannt. Da sie jedoch nicht die hohe Kalziumionen-Affinität erklären konnte, wurde in dieser Arbeit die Kristallstruktur der C2B-Domäne und ein Teil der linker-Region mittels Röntgenstrukturanalyse untersucht. Die Kristallstruktur weicht in der Kalziumbindungsstelle von der NMR-Struktur ab und erklärt durch ideale Koordination der Kalziumionen die hohe Kalzium-Affinität.Cyanobakterien sind in der Lage, sowohl Nitrat, Nitrit oder Ammonium als Stickstoffquelle zu nutzen (Stickstoff-Assimilation), als auch aus molekularem Stickstoff biologisch verwendbare Stickstoffverbindungen aufzubauen (Stickstoff-Fixierung). Sowohl Stickstoff-Assimilation als auch Stickstoff-Fixierung führen zur Bildung von Ammonium, welches als zentrales Ausgangsprodukt für den GS/GOGAT-Zyklus (Glutamin-Synthetase/ Glutamat-2-Oxoglutarat-Amidotransferase) dient. Dieser Zyklus wird über die Regulierung der Glutamin-Synthetase kontrolliert, welche von den PII-Proteinen übernommen wird. Die PII-Proteine werden dabei je nach Kohlenstoff-Stickstoffbilanz der Zelle entweder phosphoryliert oder dephosphoryliert, um in die Aktivität der Glutamin-Synthetase einzugreifen. Die Dephosphorylierung übernimmt eine PP2C-ähnliche Phosphatase (PII-Phosphatase): tPphA. Die Struktur der tPphA wurde in dieser Arbeit röntgenkristallographisch untersucht und mit anderen PP2C-ähnlichen Phosphatasen verglichen, um mögliche Rückschlüsse auf den katalytischen Mechanismus ziehen zu können. Die hohe Ähnlichkeit der tPphA mit der bakteriellen Phosphatase deutet auf einen vergleichbaren Mechanismus der beiden Phosphatasen hin, der jedoch in beiden Fällen ungeklärt ist.