Structural Analysis of the 50S Ribosomal Stalk

Abstract

Die Proteinbiosynthese ist ein dynamischer Prozess, der am Ribosom stattfindet und durch Translationsfaktoren angetrieben wird. Einige dieser Faktoren sind GTP-bindende Proteine. Sie besitzen eine limitierte inhärente GTPase-Aktivität, die über Interaktionen mit einer Region auf der großen Untereinheit des Ribosoms stimuliert wird. Diese Region besteht aus verschiedenen 23S rRNA Elementen (L10/L11 rRNA bindende Region und Sarcin-Ricin-Loop) sowie r-Proteinen, wie dem L6, L11, L14 und dem L7/L12 Fortsatz. Der L7/L12 Fortsatz gehört zu einer Erweiterung der 50S ribosomalen Untereinheit und besteht aus mehreren Kopien des Proteins L12, die über L10 an die ribosomale RNA geknüpft sind. Viele Hinweise sprechen dafür, dass L12 für die Bindung von Translationsfaktoren sowie der Stimulation ihrer GTPase-Aktivitäten essentiel ist. L12 kann funktional in drei Domänen gegliedert werden: eine N-terminale Domäne (NTD), welche für die Dimerisierung und Interaktion mit L10 verantwortlich ist, in eine C-terminale Domäne (CTD), welche für faktorverwandte Funktionen notwendig ist, sowie eine flexible Gelenkregion.Kristallographische Studien von 50S Untereinheiten und von 70S Ribosomen konnten bis heute die Struktur des L7/L12 Fortsatzes nicht klären, was sehr wahrscheinlich an der hohen Mobilität der L12 Gelenkregion liegt. Daher wurde ein Komplex generiert, bei welchem eine geringere Flexibilität zu erwarten war. Dieser Komplex umfasste L10 und die NTD des L12 aus dem hyperthermophilen Bakterium Thermotoga maritima. In den drei gewonnen Kristallstrukturen wies L10 eine globuläre NTD auf, welche über einen flexiblen Loop mit einer langen C-terminalen α-Helix verbunden war. Die Helix zeigte in verschieden Kristallformen unterschiedliche Orientierungen in Bezug zur NTD des L10 und beinhaltete die drei aufeinander folgenden Bindungsstellen für die L12 NTD-Dimere. Das Dimerisierungsmuster der L12 NTDs stimmte mit dem überein, welches für das isolierte Protein in Lösung (Bocharov et al. 2004; Moens et al. 2005), sowie im kristallinen Umfeld postuliert wurde (Wahl et al. 2000). In der Kristallstruktur des isolierten L12 aus T. maritima zeigte die Gelenkregion eines Protomers eine α-helikale Form, welche auf die L12 NTDs des Dimers gefaltet war. Im Gegensatz dazu wurde das Gelenk in tmaL10:(L12NTD)6 durch die C-terminale α-Helix des L10 ersetzt. Daher ist es wahrscheinlich, dass die Gelenkregionen im L12 im Komplex mit L10 flexibel und unstrukturiert sind, was im Einvernehmen mit diversen Studien des Proteins in Lösung steht.Die in situ Struktur der archealen L10 NTD (in Kollaboration mit F. Schlünzen, J. M. Harms, Hamburg) ermöglichte die Positionierung des isolierten tmaL10:(L12 NTD)6 Komplexes auf der ribosomalen 50S Untereinheit. Das resultierende Modell der 50S Untereinheit mit gebundenem L10:(L12)6 Komplex wurde durch ein Einpassen der Struktur in die Cryo-EM Hülle eines 70S:EF-G:GDP:Fusidinsäure Komplex aus E. coli (N. Fischer, H. Stark, Göttingen) bestätigt. Aufgrund dieser Daten und durch Strukturen des isolierten L12 kann man sich vorstellen, dass der Fortsatz in drei strukturelle und funktionale Elemente, welche durch flexible Regionen verbunden sind, organisiert ist: (i) die Fortsatz-Basis, welche durch die L10/L11 rRNA bindende Region geformt wird, L11 und die L10 NTD, welche als Anlagerungsbereiche für periphere Komponenten dienen, (ii) die C-terminale α-Helix des L10 im Komplex mit dem L12 NTD Dimer, welche eine bewegbare Plattform darstellt, die die L12 Gelenke sowie die CTDs trägt, (iii) die hochgradig mobilen L12 CTDs, die über die Gelenkregionen mit der mobilen Plattform verbunden sind. Dieses Arrangement steht im Einklang mit der Vorstellung der L12 CTD als aktive Schlüsselfigur in der dynamischen Funktion des gesamten Fortsatzes.