The Role of the Ubiquitin-Proteasome System in the Regulation of Nuclear Hormone Receptor-Dependent Transcription
Die Rolle des Ubiquitin-Proteasom-Systems bei der Regulation der nuklearen Hormonrezeptor-abhängigen Transkription
von Tanja Prenzel
Datum der mündl. Prüfung:2010-10-22
Erschienen:2011-03-23
Betreuer:Prof. Dr. Steven Johnsen
Gutachter:Prof. Dr. Steven Johnsen
Gutachter:Prof. Dr. Holger Reichardt
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Nuclear hormone receptors (NHRs) are ligand-dependent transcription factors which exert a broad range of functions in physiology and disease. Molecular therapies directed against the NHRs represent an ideal treatment for some human diseases. For example the estrogen receptor is the primary therapeutic target in a large portion of breast cancers. Upon ligand binding, transcriptional regulation by the NHRs occurs in an ordered manner which involves binding to corresponding target sequences and recruitment of transcriptional cofactors. NHRs also recruit specific ubiquitin-proteasome components to the target gene during each cycle of binding. The ubiquitin-proteasome system (UPS) is the cell s primary mechanism of controlling the half-life of intracellular proteins and is the target of cancer therapy (Bortezomib). Several lines of evidence suggest that the UPS plays an integral role in steroid hormone receptor-mediated transcription regulation. This work aimed to study the role of the UPS in the regulation of glucocorticoid receptor (GR) and more comprehensively of estrogen receptor-alpha (ERα)-mediated transcription. Proteasomal activity was inhibited either with the proteasome inhibitor Bortezomib or via transient siRNA-mediated knockdown of 20S proteasomal subunits. Transcriptome-wide gene expression analysis revealed that the expression of the bulk of estrogen-activated genes is negatively influenced by proteasome inhibition. Subsequent time course analyses showed that the effect on the regulation of target gene expression as well as receptor recruitment is dependent on gene and time. Proteasome inhibition using Bortezomib appears to be specific since similar effects, albeit weaker, were observed following knockdown of 20S subunits. Further, inhibition of proteasomal activity decreases proliferative capacity of breast cancer cells by inducing cell cycle arrest at the G2/M transition. Elucidating the mechanism by which the UPS influences transcription was one major goal of this study, thus the effects of proteasome inhibition on ERα mobility and its ability to induce long-range chromosomal interactions was investigated. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) studies showed that Bortezomib decreases ERα nuclear mobility. Furthermore, spatial chromosomal organization analysis on two ERα target genes revealed that proteasome inhibition impairs the estrogen-induced long-range intrachromosomal interactions. The data obtained in this study demonstrate the complexity by which the UPS functions in NHR-regulated transcription and provide an important basis for the further exploration of proteasome inhibitors in the treatment of diseases such as breast cancer.
Keywords: ubiquitin-proteasome system; hormone receptor; estrogen receptor; glucocorticoid receptor; chromosomal long-range interactions; gene expression; ChIP; Chromosome Conformation Capture (3C)
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Nukleare Hormonrezeptoren (NHRs) sind Liganden-abhängige Transkriptionsfaktoren mit breitem physiologischem sowie pathophysiologischem Funktionsspektrum. Molekulare Therapien die sich gegen NHRs richten, stellen eine optimale Behandlung einiger humaner Krankheiten dar. Der Östrogenrezeptor ist beispielsweise das primäre, therapeutische Ziel in einem Großteil von Brustkrebsvarianten. Nach Ligandenbindung erfolgt die NHR-regulierte Transkription, welche die Bindung an korrespondierende Zielsequenzen und Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren einschließt. Während jedem Bindungzyklus rekrutieren NHRs auch Komponenten des Ubiquitin-Proteasom-Systems an die Zielgene. Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist das wichtigste intrazelluläre Proteinabbausystem und ist Ziel in der Krebstherapie (Bortezomib). Verschiedene Indizien sprechen für eine wesentliche Rolle des UPS in Steroidhormonrezeptor-vermittelter Transkriptionskontrolle. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der UPS-Funktion in Glucocorticoidrezeptor- (GR-) und im Besonderen in Östrogenrezeptor alpha- (ERα-) vermittelter Transkription. Die Proteasomaktivität wurde entweder durch den Proteasominhibitor Bortezomib oder mittels transientem siRNA-vermittelten Knockdown von 20S Proteasomuntereinheiten inhibiert. Eine transkriptomweite Genexpressionsanalyse verdeutlichte, dass die Expression vom Großteil der Östrogen-aktivierten Gene durch Proteasominhibition negativ beeinflusst wird. Anschließende Zeitreihen-Analysen zeigten einen gen- und zeitabhängigen Effekt auf die Regulation von Gentranskription sowie Rezeptorbindung. Die Proteasominhibition mittels Bortezomib erscheint spezifisch, da ähnliche, wenn auch schwächere Effekte nach dem Knockdown von 20S Untereinheiten beobachtet wurden. Weiterhin vermindert die Inhibition der proteasomalen Aktivität die Proliferationskapazität von Brustkrebszellen durch einen induzierten Zellzyklus-Arrest im G2/M-Übergang. Ein Hauptziel war die Aufdeckung des Mechanismus, durch welchen das UPS die Transkription beeinflusst. Daher wurden ERα-Mobilität und chromosomale Interaktionen nach Proteasominhibition untersucht. FRAP-Analysen zeigten, dass Bortezomib die nukleare ERα-Mobilität verringert. Die räumliche Organisationsanalyse zweier ERα-Zielgene deckte auf, dass durch Proteasominhibition die Östrogen-induzierten intrachromosomalen Interaktionen beeinträchtigt werden. Die Ergebnisse der Arbeit verdeutlichen die komplexe Funktion des UPS in NHR-regulierter Transkription und liefern die Grundlage für die weitere Erforschung von Proteasominhibitoren in der Krankheitstherapie, wie z.B. Brustkrebs.
Schlagwörter: Ubiquitin-Proteasom-System; Hormonrezeptor; Östrogenrezeptor; Glukokortikoidrezeptor; chromosomale Interaktionen; Genexpression; ChIP; 3C