Zur Expression und Funktion von Prm3: ein ungewöhnliches Protamin

Abstract

In dieser Arbeit wurden das Protamin3-Gen (Prm3) sowie das resultierende Protein näher charakterisiert. Da das Prm3-Gen im gleichen Cluster wie die anderen Protamine (Prm1 und Prm2) lokalisiert ist und ausschließlich während der haploiden Phase der Spermatogenese (in den elongierenden Spermatiden) exprimiert wird, wurde es funktionell anfangs der Genfamilie der Protamine zugeordnet. Mittels detaillierter Northern- und Westernblot-Analysen konnte gezeigt werden, dass die Translation des Proteins erst fünf Tage nach der Transkription des Gens erfolgt, ein Befund, ähnlich dem der übrigen Protamine. Es wurde jedoch festgestellt, dass das Prm3-Protein völlig andere Eigenschaften als die übrigen Mitglieder der oben genannten Familie besitzt. Mittels 2D-Elektrophorese konnte experimentell nachgewiesen werden, dass der isoelektrische Punkt (pI) des Prm3-Proteins im Bereich pH 4-5 liegt. Prm1 und Prm2 hingegen stellen extrem basische Proteine (pH 12-13) dar, die aufgrund ihrer positiven Ladung leicht an DNA binden. Eine Funktion des Prm3-Proteins als DNA-bindendes Protein kann somit eindeutig ausgeschlossen werden.Um die subzelluläre Lokalisation des Prm3-Proteins zu bestimmen, wurden nachfolgend a) Reporter-Assays mit GFP-Konstrukten, b) immuno-chemischen Studien an einer stabilen Zelllinie, die Prm3 exprimiert und c) Antikörper-Färbungen an Testisschnitten der adulten Maus durchgeführt. Dabei konnte das Protein sowohl im Zytoplasma als auch im Kern der Zelle nachgewiesen werden. Die Anwesenheit des Prm3-Proteins in diesen beiden Kompartimenten ist ein weiteres Indiz für eine abweichende Funktion im Vergleich zu den übrigen Proteinen der Protamin-Familie. Desweiteren wurde im Yeast-Two-Hybrid- Screening nach putativen Interaktionspartnern von Prm3 gesucht. Von den ursprünglich 6 isolierten Kandidatenklonen zeigte lediglich ein Klon (ein bislang unbekannter EST-Klon) auch im Mammalian-Two-Hybrid-System eine spezifische Interaktion.Den zweiten Aspekt der Arbeit bildeten die funktionellen Analysen im lebenden Organismus. Um die Auswirkungen einer aberanten Expression von Prm3 zu studieren, wurde das Tet-On-System benutzt. Mittels verschiedener Transaktivatoren wurden doppelt-transgene Mauslinien erzeugt, in denen Prm3 sowohl in Keimzellen durch Induktion zeitlich vorgezogen als auch in somatischen Zellen exprimiert werden sollte. Die generierten Linien zeigten jedoch keine signifikanten Veränderungen der Spermatogenese oder Reduktion der Spermienzahl. Weiterhin essentiell für die Analyse der Funktion des Prm3-Gens war die Generierung einer Knock-out-Maus mittels homologer Rekombination. Dazu wurde ein Knock-out-Konstrukt kloniert und in Embryonale Stammzellen (ES) der Maus transfiziert. Nach Injektion der positiv rekombinierten ES-Zellen in Wildtyp-Blastozysten konnte eine Reihe von Chimären erzeugt werden, die das mutierte Allel an ihre Nachkommen (F1-Generation) weitergaben. Durch gezielte Verpaarungen sollen nun in der F2-Generation mutante Mäuse erzeugt werden, denen ein funktionelles Prm3 fehlt.