Untersuchungen zur Rolle des MPH1-Gens aus Saccharomyces cerevisiae bei der Reinitiation der Replikation nach schadensinduzierten Arresten
Investigations on the function of the Saccharomyces cerevisiae MPH1 gene in reinitation of replication after damage induced arrests
by Christian Rudolph
Date of Examination:2003-11-05
Date of issue:2003-12-10
Advisor:PD Dr. Wilfried Kramer
Referee:PD Dr. Harald Kolmar
Referee:Prof. Dr. Dietrich Gradmann
Referee:Prof. Dr. Hans-Ulrich Mösch
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
For the error-free removal of DNA damages the damaged bases are usually removed by mechanisms like nucleotide or base excision repair (NER, BER), mismatch repair etc. and the resulting gap is subsequently filled by a DNA polymerase. A prerequisite for these repair mechanisms is the availability of the information on the intact opposite strand. However, during replication the parental strands are separated and therefore repair by mechanisms like NER or BER cannot take place. If a lesion leads to an arrest of the replicative polymerase in E. coli and replication cannot be reinitiated, the cell will die.One possibility for an error-free reinitiation of replication are mechanisms using homologous recombination. By using the information of the sister chromatid for DNA synthesis, lesions can be bypassed in an error-free manner. Having created a 3 -end downstream the lesion the replication can be reinitiated, using this 3 -end as a primer. The lesion can subsequently be removed by repair pathways like NER or BER.The MPH1 gene from Saccharomyces cerevisiae is involved in a recombinogenic pathway for the error-free bypass of DNA lesions which can be bypassed in the absence of Mph1 by translesion polymerases. Therefore we used an assay for detection of spontaneous recombination events in the cell. Additionally, it was possible to measure the influence of the DNA-damaging agents 4-NQO and camptothecin on recombinogenic events.With this assay the influence of mutations in mph1, rev3, rad30, sgs1 and srs2 on recombination events induced by 4-NQO and camptothecin were determined and compared with spontaneous and 4-NQO induced mutations in the canavanine forward mutation system. Additionally, the effect of a heterologously expressed E. coli recG on repeat deletions, mutations and DNA damage sensitivities was measured. The data support the idea of an involvement of Mph1 in a recombinogenic pathway for rescue of arrested replication forks which are mainly stalled at structures which block the replicative polymerases. Possible roles of the other investigated genes in reinitiation and repair mechanisms are discussed.
Keywords: stalled replication forks; reinitiation of replication; DNA damage; camptothecin; 4-NQO; DNA replication; yeast
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Um Läsionen aus der DNA entfernen zu können, machen sich Reparaturmechanismen wie Nukleotid- oder Basenexcisionsreparatur, mismatch-Reparatur etc. die Tatsache zu Nutze, daß die Information auf beiden Strängen vorhanden ist. Der geschädigte Bereich wird ausgeschnitten und die entstehende Lücke mit Hilfe einer DNA-Polymerase fehlerfrei wieder geschlossen. Ein Problem stellen daher Läsionen dar, welche die replikativen Polymerasen arretieren, da hier die Stränge entwunden vorliegen und die Information vom Doppelstrang primär nicht zur Verfügung steht. Arretiert die Replikation in einem Organismus wie E. coli dauerhaft, führt dies zum Tod der betroffenen Zelle.Eine Möglichkeit zur fehlerfreien Reinitiation der Replikation sind rekombinative Mechanismen, durch welche die Information des Schwesterchromatids für die fehlerfreie Umgehung der Schäden genutzt werden kann. Ist durch eine solche Umgehung ein elongierbares 3 -Ende hinter der Läsion entstanden, kann die Replikation reinitiiert und die Läsion später durch die herkömmlichen Reparaturmechanismen fehlerfrei entfernt werden.Für das MPH1-Gen von Saccharomyces cerevisiae wird angenommen, daß es an einem rekombinativen Prozeß zur fehlerfreien Umgehung von DNA-Läsionen beteiligt ist. Es wurde daher ein experimentelles System zum Nachweis solcher Rekombinationsereignisse entwickelt. Mit Hilfe dieses Systems wurden sowohl die spontanen Raten wie auch die durch die Mutagene 4-NQO und Camptothecin induzierten Frequenzen auftretender Rekombinationsereignisse in mph1-, rad30-, rev3-, sgs1- und srs2-Mutanten sowie der entsprechenden Doppelmutanten mit mph1 ermittelt. Zusätzlich wurden die durch 4-NQO induzierten Mutationsfrequenzen mit Hilfe des Canavanin-Vorwärtsmutationssystems bestimmt und mit den spontanen Rekombinationsraten sowie den Rekombinationsfrequenzen nach Chemikalienbehandlung verglichen. Außerdem wurden die Mutationsraten sowie die spontan sowie nach Mutagenbehandlung auftretenden Rekombinationsereignisse in Hefestämmen, welche recG aus E. coli exprimierten, bestimmt.Die gewonnen Daten unterstützen die Hypothese, daß Mph1 an einem fehlerfreien Weg zur Reinitiation von Replikationsgabeln beteiligt ist, welche an Läsionen arretiert wurden, die in Abwesenheit von Mph1 durch die Transläsionssynthese fehlerbehaftet überlesen werden können. Die möglichen Funktionen der weiteren untersuchten Gene werden diskutiert.
Schlagwörter: arretierte Replikationsgabeln; Reinitiation der Replikation; DNA-Schäden; Camptothecin; 4-NQO; DNA-Replikation; Hefe