Die Na+/H+-Austauscher-abhängige pH-Regulation in Vorhof- und Ventrikelmyozyten
The Na+/H+-exchanger (NHE-1)-dependent pHi regulation in atrial and ventricular myocytes
by Hui Yan
Date of Examination:2011-10-26
Date of issue:2011-08-22
Advisor:PD Dr. Jens Kockskämper
Referee:Prof. Dr. Gerhard Burckhardt
Referee:Prof. Dr. Dr. Thomas Crozier
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Size:1.88Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The Na+/H+-exchanger (NHE) is significantly involved in pHi regulation. Its activation is of particular importance from the pathophysiological perspective. In order to investigate the question of whether there are differences in NHE-1-dependent, global and sub-cellular pHi regulation between atrial and ventricular myocytes and whether there are differences in NHE expression between human atrial and venricular tissue and in different cardiac diseases, sub-cellular H+ homeostasis and the activity of NHE-1 was assessed in different sub-cellular regions of atrial and ventricular myocytes from the heart of the rabbit, and the expression of NHE-1 in healthy and insufficient human myocardium was measured and compared using the Western Blot method. The activity of NHE-1 was determined with reference to NHE-dependent pHi changes in different sub-cellular regions in atrial and ventricular myocytes of rabbits. For this purpose, the NH4Cl acid pulse method in conjunction with a pH-sensitive fluorescent dye, 5-carboxy-SNARF®-1, was used. The use of a confocal microscope allowed the measurement of sub-cellular changes in fluorescence to be made. The specificity of the method was demonstrated in control experiments with the NHE-1-specific inhibitor HOE642. The changes in fluorescence were calibrated and converted into changes in pHi. The rate of H+ efflux at pH 6.9 (JpH6,9) was chosen as a measure of the activity of NHE-1. It was found that the global NHE-1-dependent-JpH6,9 in ventricular myocytes was significantly larger than in atrial myocytes and the JpH6,9 in the centre of the ventricular myocytes was significantly larger than in the atrial myocytes, respectively. The sub-cellular NHE-1-dependent JpH6,9 was of a similar size in both the ventricular myocytes and the atrial myocytes in all sub-cellular regions. In quantitative measurements of NHE-1 protein, likewise no difference was found between human non-insufficient ventricular and atrial myocardium using the Western Blot method. It is therefore concluded that ventricular myocytes show significantly greater NHE-1-mediated H+ elimination (5 mM/min versus 3.2 mM/min in atrial myocytes). Measurable radial pH gradients could neither be observed in ventricular nor in atrial myocytes. Comparing NHE-1 expression between insufficient and non-insufficient ventricular myocardium, an increased expression of NHE-1 in insufficient human ventricular myocardium was revealed.
Keywords: the Na+/H+-exchanger (NHE); global and sub-cellular pHi regulation: atrial and ventricular myocytes; HOE642 (Cariporide); 5-Carboxy-SNARF®-1; the rate of H+ efflux at pH 6.9 (JpH6,9); expression
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Der Na+/H+-Austauscher (NHE) ist maßgeblich an der pHi-Regulation beteiligt. Seine Aktivierung ist pathophysiologisch von besonderer Bedeutung. Zu den Fragen, ob es Unterschiede in der NHE-1-abhängigen, globalen und subzellulären pHi- Regulation zwischen Vorhof- und Ventrikelmyozyten gibt, und ob es Unterschiede in der NHE-Expression zwischen humanem Vorhof- und Ventrikelgewebe und bei verschiedenen Herzerkrankungen gibt, wurde in dieser Arbeit die subzelluläre H+-Homöostase und die Aktivität des NHE-1 in verschiedenen subzellulären Regionen von Vorhof- und Ventrikelmyozyten aus dem Kaninchenherzen gemessen und die Expression des NHE-1 in gesundem und insuffizientem humanen Myokard durch die Western-Blot-Methode gemessen und verglichen. Die Aktivität des NHE-1 wurde anhand von NHE-abhängigen pHi-Änderungen ermittelt in verschiedenen subzellulären Regionen in Vorhof- und Ventrikelmyozyten aus Kaninchen. Dazu wurde die NH4Cl-Säurepuls-Methode in Verbindung mit einem pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff, 5-Carboxy-SNARF®-1, verwendet. Der Einsatz der Konfokalmikroskopie erlaubte die Messung subzellulärer Fluoreszenzänderungen. Die Spezifität der Methode wurde durch Kontrollexperimente mit einem NHE-1-spezifischen Hemmstoff, HOE642, nachgewiesen. Die Fluroreszenzänderungen wurden geeicht und in pHi-Änderungen umgerechnet. Die Rate des H+-Efflux bei pH 6,9 (JpH6,9) wurde als Maß für die Aktivität des NHE-1 bestimmt. Es zeigte sich, dass die globale NHE-1-abhängige-JpH6,9 in Ventrikelmyozyten deutlich größer als in Vorhofmyozyten bzw. die JpH6,9 im Zentrum der Ventrikelmyozyten signifikant größer als in Vorhofmyozyten war. Die subzelluläre NHE-1-abhängige-JpH6,9 war sowohl in den Ventrikelmyozyten als auch in den Vorhofmyozyten in allen subzellulären Regionen ähnlich groß. Bei den quantitativen Messungen des NHE-1-Proteins wurde ebenfalls kein Unterschied zwischen humanem nicht-insuffizientem Ventrikel- und Vorhofmyokard durch die Western-Blot-Methode nachgewiesen. Es lässt sich abschließend feststellen, dass Ventrikelmyoyzten eine deutlich größere NHE-1-vermittelte H+-Elimination (5 mM/min versus 3,2 mM/min in Vorhofmyoyzten) besitzen. Messbare radiale pH-Gradienten konnten weder in Ventrikel- noch in Vorhofmyoyzten beobachtet werden. Beim Vergleich der NHE-1-Expression zwischen insuffizientem und nicht-insuffizientem Vertrikelmyokard konnte eine erhöhte Expression des NHE-1 im insuffizienten humanen Vertrikelmyokard nachgewiesen werden.
Schlagwörter: Der Na+/H+-Austauscher (NHE); globalen und subzellulären pHi- Regulation; Vorhof- und Ventrikelmyozyten; HOE642 (Cariporide); 5-Carboxy-SNARF®-1; Die Rate des H+-Efflux bei pH 6,9 (JpH6,9); Die NHE-1-