Über die Bedeutung der Zugabe von humanem Serum-Albumin zu exogenen GLP-1-Infusionen am Beispiel der Antagonisierbarkeit des GLP-1 [7-36-Amid]-Einflusses auf die erste Phase der Insulin-Sekretion nach intravenöser Glukosegabe durch den GLP-1-Rezeptor-Antagonisten Exendin [9-39] bei gesunden Menschen
About the importance of the addition of human serum albumin to exogenous GLP-1 infusion on the example of Antagonized the GLP-1 [7-36 amide] influence on the first phase insulin secretion after intravenous administration of glucose by the GLP-1 receptor antagonist Exendin [9-39] in healthy humans
by Lars Dietrich Köthe
Date of Examination:2011-10-11
Date of issue:2011-08-31
Advisor:Prof. Dr. Michael Nauck
Referee:Prof. Dr. Michael Nauck
Referee:Prof. Dr. Hubertus Jarry
Referee:Prof. Dr. Martin Oppermann
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Background/aims: Exendin [9-39] has been used as a specific GLP-1 antagonist in order to elucidate the role of endogenously secreted GLP-1 as an incretin. We examined, whether published doses of exendin [9-39] can completely block the insulinotropic activity of exogenous GLP-1. In two series of experiments, GLP-1 infusates with and without the addition of human serum albumin were compared. Subjects/methods: 6 healthy subjects (project 1: men/women: 5/1 age 47 ± 8 years ; BMI 25.9 ± 4.2 kg/m2; HbA1c 5.2 ± 0.3 %; project 2: men/women: 4/2; age 45 ± 12 years; BMI 23.5 ± 1.9 kg/m2, HbA1c 5.3 ± 0.1 %) participated. All had a normal oral glucose tolerance. Studies were performed in the morning after an overnight fast. At 30 min or 45 min prior to bolus injection of glucose, the exogenous GLP-1 was infused iv at a rate of 0.5 pmol.kg-1.min-1 or 1.0 (for 15 min) followed by 0.5 pmol.kg-1.min-1 with or without the addition of 1 % human serum albumin. For comparison, placebo was infused on a separate occasion. Exendin [9-39] was administered intravenously starting 60 min prior to glucose administration at 500 (for 60 min) followed by 350 pmol.kg-1.min-1 in addition to GLP-1. Glucose 0.3 g/k was injected at time 0, and blood drawn at baseline and for at least 120 min thereafter. Glucose (capillary), insulin, C-peptide, GLP-1, exendin [9-39] and glucagon were determ ined with specific immunoassays. Insulin secretion rates were calculated by deconvolution. Changes in parameters were analyzed by repeated-measures analysis of variance. Results: Without albumin added to GLP-1 infusates, GLP-1 levels rose slowly throughout the observation period. No significant stimulation of first-phase insulin secretion in response to the glucose bolus was observed, and no inhibition by exendin [9-39] could be demonstrated. When albumin was added to GLP-1 infusates, total GLP-1 concentrations increased from baseline reaching 83 ± 29 pmol/l (GLP-1 alone)and 138 ± 25 pmol/l (GLP-1 with exendin [9-39]) after 15 min and 53 ± 14 pmol/l (GLP-1 alone) and 61 ± 5 pmol/l (GLP-1 with exendin [9-39]) at time 0 min and remained in this range for the remainder of the study. Intact GLP-1 was elevated in proportion to total GLP-1. First-phase insulin secretion was augmented by GLP-1 from 314 ± 24 to 714 ± 104 pmol/kg (p < 0.05 vs. placebo): The addition of exendin [9-39] completely prevented this effect (338 ± 44 pmol/kg; p < 0.05 vs. GLP-1). No relevant side effects of exendin [9-39] were observed at levels up to 176 ± 17 ! nmol/l at 60 min or 207 ± 19 nmol/l at 210 min. Conclusions: Exendin [9-39] is a suitable GLP-1 receptor antagonist for human studies. In order to ascertain the rapid appearance of exogenous GLP-1 in the circulation upon infusion, human serum albumin needs to be added to the infusate to prevent binding of the peptide to plastic surfaces.
Keywords: GLP-1 GLP-1-(7-36-amid) Exendin-[9-39] Exendin human-serum-albumin insulin-secretion GLP-1-receptor-antagonist
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Exendin [9-39] wird als spezifischer GLP-1 Antagonist zur Erforschung der Wirkung des endogenen GLP-1 als Inkretin eingesetzt. Aus dem Toxin der Unterkieferdrüsen der Gila Krustenechse (Heloderma suspectum) konnte ein Peptid namens Exendin-4 isoliert werden, und es zeigte sich, dass dieses Protein ein potenter Agonist an GLP-1 Rezeptoren sowohl der Ratte als auch des Menschen ist. Exendin-4 zeigt eine 53 %ige Sequenzhomologie zu GLP-1 [7-36-amid]. Seine trunkierte Form Exendin [9-39] zeigt hingegen eine spezifische, antagonistische Wirkung am GLP-1 Rezeptor, ohne jegliche agonistische Wirkung. Dies ließ sich in in vitro und in vivo Versuchen am Tiermodell bestätigen. Beim Menschen konnte mit Applikationsdosen von 300 pmol/kg/min Exendin [9-39] sowohl der insulinotrope Effekt von exogenem GLP-1, als auch die Glukagonsekretions-hemmende Wirkung des GLP-1 vollständig aufgehoben werden. Im Rahmen dieser Arbeit sollte nachgewiesen werden, dass die gewählte intravenöse Applikationsdosis von Exendin [9-39] suffizient die insulinotrope Wirkung des parallel zugeführten exogenen GLP-1 [7-36-amid] hemmen kann, um zu demonstrieren, dass mit der gleichen Dosis Wirkungen von endogen sezerniertem GLP-1 ebenfalls vollständig unterdrückt werden. Zur Darstellung der Notwendigkeit einer besonderen Behandlung von exogenen GLP-1 Infusionen wurden zwei Applikationsformen von GLP-1 [7-36-amid] miteinander verglichen. Zum einen ohne Zusatz von humanem Serumalbumin (Projekt A) und zum anderen mit Zusatz von humanem Serumalbumin (Projekt B). Projekt A (GLP-1 ohne Zusatz von Albumin): 6 Probanden (m/w: 5/1; Alter: 47 ± 8 Jahre; BMI: 25,9 ± 4,2kg/m²; HbA1c: 5,2 ± 0,5%) mit normaler Glukosetoleranz erhielten an drei Versuchstagen Infusionen mit 1.) NaCl 0,9%, 2.) GLP-1 [7-36-amid] oder 3.) GLP-1 [7-36-amid] + Exendin [9-39] in Kombination. Unter den Infusionen wurde zum Zeitpunkt 0 eine intravenöse Glukosebelastung mit 0,3g/kg Körpergewicht innerhalb von 10 Sekunden durchgeführt. Vor und nach der Glukosegabe wurden zu definierten Zeitpunkten Blutentnahmen durchgeführt und kapilläre Blutglukose, C-Peptid, Insulin, GLP-1 (intakt), GLP-1 (total), Exendin [9-39] und Glukagon bestimmt. Die Insulin-Sekretionsrate wurde über die Dekonvulotion berechnet und die statistische Auswertung erfolgte über eine Varianzanalyse mit Messwiederholungen. Projekt B (GLP-1 mit Zusatz von Albumin): 6 Probanden (m/w 4/2; Alter: 45 ± 12 Jahre, BMI: 23,5 ± 1,9kg/m²; HbA1c: 5,3 ± 0,1%) mit normaler Glukosetoleranz erhielten an drei Versuchstagen Infusionen mit 1.) NaCl 0,9%, 2.) GLP-1 [7-36-amid] oder 3.) GLP-1 [7-36-amid] + Exendin [9-39] in Kombination. Unter den Infusionen wurde zum Zeitpunkt 0 eine intravenöse Glukosebelastung mit 0,3g/kg Körpergewicht innerhalb von 10 Sekunden durchgeführt. Vor und nach der Glukosegabe wurden zu definierten Zeitpunkten Blutentnahmen durchgeführt und kapilläre Blutglukose, C-Peptid, Insulin, GLP-1 (intakt), GLP-1 (total), Exendin [9-39] und Glukagon bestimmt. Die Insulin-Sekretionsrate wurde über die Dekonvulotion berechnet und die statistische Auswertung erfolgte über eine Varianzanalyse mit Messwiederholungen In Projekt A fand sich unter der GLP-1 Infusion ohne Zusatz von humanem Serumalbumin ein unzureichender Anstieg der GLP-1 Konzentration. Im Gegensatz dazu kam es in Projekt B unter Zusatz von humanem Serumalbumin zu einem raschen Anstieg der GLP-1 Konzentration. 15 Minuten nach Infusionsbeginn ließen sich Konzentrationen von 83 ± 29 pmol/l (GLP-1 Infusion) bzw. 138 ± 25 pmol/l (kombinierte GLP-1 und Exendin [9-39] Infusion) messen. Nach Reduktion der Infusionsgeschwindigkeit sank der GLP-1 Spiegel auf 53 ± 14 pmol/l (GLP-1 Infusion) und 61 ± 5 pmol/l (kombinierte GLP-1 und Exendin [9-39] Infusion) und hielt sich stabil auf diesem Niveau. Nur in Projekt B (GLP-1 mit Zusatz von Albumin) konnte nach der intravenösen Glukosegabe ein Anstieg der Insulin-Sekretionsrate in der ersten Phase von 103 ± 13 pmol/kg (NaCl 0,9% Infusion) auf 234 ± 40 pmol/kg (GLP-1 Infusion) nachgewiesen werden (p < 0,05 vs NaCl 0,9% Infusion). Dieser Effekt konnte durch die gleichzeitige Gabe von Exendin [9-39] komplett antagonisiert werden. Die Insulin-Sekretionsrate betrug in der ersten Phase dann 111 ± 14 pmol/l (kombinierte GLP-1 und Exendin [9-39] Infusion) (p< 0,05 vs GLP-1 Infusion). Die Glukagonkonzentrationen waren signifikant erhöht unter der kombinierten Infusion von GLP-1 und Exendin [9-39] als Ausdruck der Hemmung des inhibitorischen Einflusses des GLP-1 auf die Glukagonsekretion (p< 0,05 vs GLP-1 Infusion). Somit scheint Exendin [9-39] ein potenter Antagonist von GLP-1 zu sein und es kann in der gewählten Konzentration die insulinotrope und die glukagonsekretions-hemmende Wirkung einer pharmakologischen Dosis von exogenem GLP-1 komplett aufheben. Exendin [9-39] ist wahrscheinlich geeignet zur vollständigen Suppression der Wirkung auch von endogen sezerniertem GLP-1. Die Antogonisierung von GLP-1-Wirkung mit Exendin [9-39] führt zum Anstieg des Glukagons, weil bereits im Basalzustand GLP-1 die Glukagonsekretion supprimiert. Zur Vermeidung der Adsorption von GLP-1 (und anderen Peptiden) an Plastik- und Glasoberflächen im Rahmen von Infusionen muss Albumin zugesetzt werden. Sonst kommt es zu zögerlichen und der Kontrolle entzogenen, wenig berechenbaren GLP-1 Konzentrationen.
Schlagwörter: GLP-1 GLP-1-(7-36-amid) Exendin-[9-39] Exendin Albumin Insulinsekretion Bindungsverlust GLP-1-Antagonist Glukagonsekretion