Three-dimensional protein structure determination by high-resolution solid-state NMR spectroscopy
Dreidimensionale Proteinstrukturbestimmung mit Hilfe von hochaufgelöster Festkörper-NMR-Spektroskopie
von Adam Lange
Datum der mündl. Prüfung:2006-04-18
Erschienen:2006-06-13
Betreuer:Prof. Dr. Tim Salditt
Gutachter:Prof. Dr. Christian Griesinger
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
In this thesis a general concept for three-dimensional (3D) structure determination of uniformly [13C, 15N] labeled proteins by solid-state NMR spectroscopy has been developed. It is based on the combination of indirectly detected 1H-1H distance constraints and chemical shift derived backbone dihedral angle constraints. The collection of multiple distance constraints in two-dimensional CHHC and NHHC experiments has only recently been introduced. In order to include indirectly detected 1H-1H distance constraints in a molecular structure calculation, a comprehensive analysis of 1H-1H transfer in the solid-state was therefore mandatory. The concept was applied to the uniformly [13C, 15N] labeled 38-residue peptide kaliotoxin (KTX). Assigned CHHC correlations and chemical shift derived backbone dihedral angles (analyzed with the program TALOS) were used to determine a de novo 3D structure of KTX. CHHC data can also be used to obtain 3D structures of non-peptidic molecules. This was demonstrated on the [13C] labeled compound epothilone B, that binds with high affinity to polymerized tubulin. Finally the usage of high-resolution solid-state NMR spectroscopy to the investigation of high-affinity scorpion toxin / potassium channel interactions is described.
Keywords: Kaliotoxin; NMR; ion channel; protein structures; MAS; Solid-state NMR; CHHC; NHHC
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In dieser Arbeit wurde ein allgemeines Konzept zur dreidimensionalen (3D) Strukturbestimmung von gleichförmig [13C, 15N] isotopenmarkierten Proteinen mittels Festkörper-NMR-Spektroskopie entwickelt. Es basiert auf der Kombination indirekt detektierter 1H-1H Abstände und über chemische Verschiebungen bestimmter Torsionswinkel. Die simultane Bestimmung mehrerer Abstände in zwei-dimensionalen CHHC- und NHHC-Experimenten wurde erst kürzlich eingeführt. Daher war es notwendig, den 1H-1H Transfer im Festkörper gründlich zu untersuchen, um 1H-1H Abstände in einer molekularen Strukturbestimmung zu verwenden. Das Konzept wurde an dem 38-Reste-Peptid Kaliotoxin (KTX) erfolgreich erprobt. Zugeordnete CHHC-Korrelationen und über chemische Verschiebungen bestimmte Torsionswinkel (analysiert mit dem Programm TALOS) wurden verwendet, um eine de novo 3D Struktur von KTX zu bestimmen. CHHC-Daten können auch zur Strukturanalyse von nichtpeptidischen Molekülen verwendet werden. Dies wurde an der [13C] isotopenmarkierten Substanz Epothilon B, die an polymerisiertes Tubulin bindet, demonstriert. Schließlich wird in der Arbeit die Verwendung von hochaufgelöster Festkörper-NMR-Spektroskopie zur Untersuchung hochaffiner Skorpiontoxin-Kaliumkanal Wechselwirkungen beschrieben.
Schlagwörter: Kaliotoxin; NMR; Ionenkanal; Proteinstrukturen; MAS; Festkörper-NMR; CHHC; NHHC