dc.contributor.advisor | Knepel, Willhart Prof. Dr. | de |
dc.contributor.author | Matsiulka, Andrei | de |
dc.date.accessioned | 2012-05-16T12:09:01Z | de |
dc.date.available | 2013-01-30T23:50:43Z | de |
dc.date.issued | 2007-02-12 | de |
dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B61A-9 | de |
dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1300 | |
dc.description.abstract | Das Peptidhormon Glucagon ist der funktionelle
Antagonist von Insulin and fördert die
Glucose-Freisetzung aus der Leber. Insulin hemmt die
Glucagon-Sekretion und die Glucagongen-Transkription.
Eine Insulin-Restistenz dagegen führt zu
Hyperglucagonämie, die zu der verschlechterten
Glucosetoleranz im Diabetes mellitus Typ 2 beiträgt.
Ergebnisse früherer Studien führten zu der Annahme,
dass bei der Hemmung der Glucagongen-Transkription
durch Insulin die Glykogensynthasekinase 3 Beta (GSK3
Beta) beteiligt ist.Der Coaktivator CBP (CREB-Bindprotein), von dem
gezeigt wurde, dass er für die Aktivierung der
Glucagongen-Transkription essentiell ist, wird durch
die GSK3 Beta an seinem C-terminalen Ende
phosphoryliert. In der vorliegenden Arbeit wurden
potentielle Phosphorylierungsstellen, die durch die
GSK3 Beta phosphoryliert werden könnten, innerhalb des
C-terminalen Endes identifiziert und hinsichtlich ihrer
funktionellen Bedeutung für die Regulation der
Glukagongen-Transkription charakterisiert.Mit drei C-terminalen Fragmenten des CBPs wurden
in vitro-Phosphorylierungen
mit rekombinanter GSK3 Beta durchgeführt. Auch ohne
vorherige Phosphorylierung durch andere Kinasen
phosphorylierte GSK3 Beta ein GST-fusioniertes
C-terminales Fragment von CBP, das die Aminosäuren
2300-2441 umfasste. Die Phosphorylierung in vivo wurde durch zwei Methoden
untersucht: MALDI-TOF Massenspektrometrie und
Immunprezipitation mit phospho-spezifischen
Nachweisantikörpern. Beide Methoden waren nicht zum
Nachweis der CBP-Phosphorylierung geeignet.Durch eine Computer-gestütze Analyse wurde die GSK3
Beta-Substrat-Erkennungssequenz mit der C-terminalen
CBP-Sequenz und der entsprechenden Sequenz des
CBP-Homologen p300 verglichen. Die Aminosäuren Serin
2420 und 2424 wurden als potentielle GSK3 Beta
-Zielstrukturen identifiziert. Diese Aminosäuren wurden
zu Alanin mutiert und die mutierten CBP-Fragmente als
GST-Fusionsproteine in in
vitro-GSK3 Beta-Phophorylierungsexperimente
eingesetzt. Die Ergebnisse zeigten, dass die
eingefügten Mutationen die Phosphorylierung des
CBP-Fragments 2300-2441 deutlich verringerte.Um die funktionelle Bedeutung der entdeckten GSK3
Beta-Phosphorylierungsstellen zu untersuchen, wurden
transiente Transfektionen durchgeführt. CBP, welches
das mutierte Serin 2424 enthielt, vermittelte eine
signifikant verminderte Aktivierung durch GSK3 Beta der
Glucagongen-Transkription. Die CBP-S2420A-Mutante
beeinflusste diese Aktivierung der
Glukagongen-Transkription nicht. Die Insulin-induzierte
Hemmung der transkriptionellen Aktivität von CBP am
Glukagongen wurde durch die eingesetzten Mutanten nicht
aufgehoben.Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass
in CBP Serin 2424 durch die GSK3 Beta in vitro phosphoryliert wird und
in vivo die GSK3
Beta-induzierte Aktivierung der
Glukagongen-Transkription vermittelt. Die
Phosphorylierung durch die GSK3 Beta könnte den
Nukleoproteinkomplex am Glukagongen-Promotor
stabilisieren. Insulin könnte durch die Hemmung der
GSK3 Beta diesen Komplex zerstören und dadurch die
Glukagongen-Transkription unterdrücken. Da die Mutation
des Serin 2424 nicht ausreichend war, um einen dem
Insulin vergleichbaren inhibitorischen Effekt auf die
Glukagongen-Transkription auszuüben, existieren
vermutlich weitere GSK3 Beta-Phosphorylierungsstellen
im CBP. | de |
dc.format.mimetype | application/pdf | de |
dc.language.iso | eng | de |
dc.rights.uri | http://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html | de |
dc.title | Regulation by Glycogen Synthase Kinase-3 Beta of CBP transcriptional coactivator involved in insulin-dependent glucagon gene transcription | de |
dc.type | doctoralThesis | de |
dc.title.translated | Die Regulation des in die Insulin-abhöngige Glukagongentranskription involvierten transkriptionellen Aktivators CBP durch die Glykogen-Synthase-Kinase-3 Beta | de |
dc.contributor.referee | Hardeland, Rüdiger Prof. Dr. | de |
dc.date.examination | 2007-01-16 | de |
dc.subject.dnb | 500 Naturwissenschaften allgemein | de |
dc.description.abstracteng | The peptide hormone glucagon is a functional
antagonist of insulin and it stimulates glucose output
from the liver. Insulin inhibits glucagon secretion and
glucagon gene transcription. Insulin resistance leads
to hyperglucagonemia contributing to impaired glucose
tolerance in diabetes mellitus type 2. Previous studies
suggested that the insulin-induced inhibition of the
glucagon gene involves glycogen synthase kinase 3 Beta
(GSK3 Beta). CBP was shown to be crucial for the
activation of the glucagon gene in the alpha cells and
to be phosphorylated in
vitro by GSK3 Beta on its C-terminal end. In the
present study GSK3 Beta phosphorylation sites within
the C-terminus of CBP were mapped and their functional
significance in the regulation of glucagon gene
transcription was investigated.An in vitro kinase assay
using three C-terminal CBP fragments was performed.
Even in the absence of a priming phosphorylation by
another kinase, recombinant GSK3 Beta phosphorylated a
GST-fused C-terminal fragment of CBP consisting of
amino acids 2300-2441. Two methods, MALDI-TOF mass
spectrometry and immunoprecipitation followed by
phosphor-specific immunoblot, were used and found not
to be suitable to study phosphorylation in vivo.Computer analysis, utilizing the GSK3 Beta substrate
recognition sequence and a sequence comparison between
CBP and its closely related homologue p300, provided
evidence that serine-2420 and serine-2424 might serve
as potential GSK3 Beta targets. Subsequently, these
sites were mutated to alanine and the respected
GST-fused proteins were subjected to the in vitro kinase assay with recombinant
GSK3 Beta. The results obtained showed that the
introduced mutations markedly reduced the
phosphorylation of CBP (2300-2441) by GSK3 Beta.In order to test the functional significance of the
discovered GSK3 Beta-target sites, transient
transfection assays were performed. CBP, containing
mutated serine-2424, conferred a significantly reduced
activation by GSK3 Beta to the glucagon gene. The
CBP-S2420A-mediated activation by GSK3 Beta was
unimpaired. The insulin-induced inhibition of CBP
transcriptional activity of the glucagon gene was not
relieved by these mutations.Taken together, the results of the present study
show that serine-2424 of CBP is phosphorylated by GSK3
Beta in vitro and confers
GSK3 Beta activation of the glucagon gene in vivo. The phosphorylation of CBP by
GSK3 Beta might stabilize the nucleoprotein complex on
the glucagon gene. Through inhibition of GSK3, insulin
might repress gene transcription by disruption of a
glucagon promoter-specific protein complex. The fact,
that the mutation of serine-2424 was not sufficient to
mimic the inhibitory effect of insulin on the glucagon
gene transcription, suggests that additional GSK3 Beta
phosphorylation sites exist. | de |
dc.contributor.coReferee | Doenecke, Detlef Prof. Dr. | de |
dc.subject.topic | Mathematics and Computer Science | de |
dc.subject.ger | Insulin | de |
dc.subject.ger | Glukagon | de |
dc.subject.ger | GSK-3 | de |
dc.subject.ger | Glukagon-produzierenden Alphazellen | de |
dc.subject.ger | CBP | de |
dc.subject.eng | Insulin | de |
dc.subject.eng | Glucagon | de |
dc.subject.eng | GSK-3 | de |
dc.subject.eng | Glucagon-producing alpha cells | de |
dc.subject.eng | CBP | de |
dc.subject.bk | Biologie | de |
dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1417-5 | de |
dc.identifier.purl | webdoc-1417 | de |
dc.affiliation.institute | Medizinische Fakultät | de |
dc.subject.gokfull | Cytologie | de |
dc.subject.gokfull | Histologie | de |
dc.subject.gokfull | Zellbiologie | de |
dc.subject.gokfull | Zellkultur | de |
dc.subject.gokfull | Zytologie | de |
dc.identifier.ppn | 57921009X | de |