Mobilisierung von Speicherlipiden in Cucumis sativus- und Arabodopsis thaliana-Keimlingen
Mobilisation of storage lipids in Cucumis sativus and Arabidopsis thaliana seedlings
von Maike Rudolph
Datum der mündl. Prüfung:2008-01-23
Erschienen:2008-12-12
Betreuer:Prof. Dr. Ivo Feußner
Gutachter:Prof. Dr. Ivo Feußner
Gutachter:Prof. Dr. Oliver Einsle
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Germination of oilseeds is characterized by mobilisation of TAGs that are stored in lipid bodies and serve as carbon source. Beside the classical degradation pathway of these storage lipids via the direct action of a triacylglycerol lipase (TGL), an alternative degradation pathway that is dependent on a specific lipid body trilinoleate 13-lipoxygenase (13-LOX) has been found in some plant species. In cucumber seedlings the activity of this specific 13-LOX (CsLbLOX) leads to the formation of ester lipid hydroperoxides (13-HPOD) in the storage lipid fraction. These hydroperoxy fatty acid derivatives where then preferentially cleaved off by a specific TGL and seem to be the substrate for glyoxisomal β-oxidation. As a prerequisite for mobilisation of storage lipids a partial degradation of the phospholipid monolayer of the lipid bodies appears to be necessary. This facilitates access of lipid mobilising enzymes to their substrates inside the lipid bodies. In this context lipid bodies from cucumber cotyledons were isolated and lipid body proteins, enzyme activities as well as storage lipids were analysed. Simultaneously with the detection of LOX activity, the transient accumulation of CsLbLOX, and with the formation of lipid bound 13-HPOD and oxygenated TAG species in lipid bodies during germination, the expression of the patatin-like PLA2 CsPAT and a transient PLA2 activity were observed. Furthermore, CsPAT as well as CsLbLOX could be localised at the lipid body membranes. Analyses of membrane phospholipids of the lipid body showed a decrease in the amount of PC that was accompanied by the accumulation of its degradation product LPC at the same time of germination as PLA2 activity was detectable. Additionally, in vitro experiments with isolated lipid bodies from mature seeds revealed that the formation of 13-HPOD first became visible after incubation with the purified recombinant patatin-like protein. These investigations suggest, that in vivo the degradation of storage lipids is initiated by the activity of CsPAT, which facilitates a decomposition of the lipid body membrane and thereby the substrate for the 13-LOX as well as the TGL becomes accessible.Transgenic expression of CsPAT and CsLbLOX in tobacco seeds did not result in degradation of storage lipids at an early stage or in a definite accumulation of lipid hydroperoxides. An involvement of the transgenic proteins in the wound reaction of tobacco leaves could not be detected as well. Sequencing of lipid body proteins from cucumber and Arabidopsis seedlings did not reveal TGL sequences, which represent possible candidates degrading storage lipids. Heterologous expression of the putative germination specific TGLs AtTGL1 and AtTGL2 from A. thaliana in insect cells and in P. pastoris with sufficient amounts of protein as well as detection of TGL activity of these enzymes was not successful so far. The physiological function of AtTGL1 and AtTGL2 remains unclear.
Keywords: storage lipid degradation; lipoxygenase; patatin-like phospholipase; phospholipid monolayer
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Die Keimung von Ölsaaten ist durch die Mobilisierung
der in den Lipidkörpern gespeicherten TAGs als
Kohlenstoffquelle charakterisiert. Neben dem
klassischen Abbauweg dieser Speicherlipide, der direkt
durch die Aktivität einer TGL initiiert wird, wurde in
einigen Pflanzenarten ein alternativer Abbauweg
gefunden, der von einer spezifischen, am Lipidkörper
lokalisierten 13-LOX abhängig ist. In Gurkenkeimlingen
führt die Aktivität der 13-LOX (CsLbLOX) zur Bildung
von veresterten Hydroperoxiden (13-HPOD) in den
Speicherlipiden, welche durch eine hochspezifische TGL
hydrolysiert werden und das Substrat der glyoxysomalen
β-Oxidation darstellen. Als Voraussetzung für die
Mobilisierung der Speicherlipide scheint zudem ein
teilweiser Abbau der Lipidkörpermembran notwendig zu
sein. So bekommen die lipidmobilisierenden Enzyme
Zugang zu ihren Substraten im Inneren des Lipidkörpers.
Diesbezüglich wurden die Lipidkörper aus den
Keimblättern der Gurke isoliert und die
Lipidkörperproteine, Enzymaktivitäten sowie die
Speicherlipide untersucht. Gleichzeitig mit dem
Nachweis von LOX-Aktivität, der zugehörigen transienten
Akkumulation des Proteins und der Bildung von
lipidgebundenem 13-HPOD sowie mehrfach oxygenierten
TAGs im Lipidkörper während der Keimung wurde die
Expression der Patatin-ähnlichen PLA2 CsPAT
und eine transiente PLA2-Aktivität am
Lipidkörper beobachtet. Desweiteren konnte CsPAT
intrazellulär genauso wie die CsLbLOX an der
Lipidkörpermembran lokalisiert werden. Untersuchungen
der Membranphospholipide des Lipidkörpers zeigten
parallel zu der detektierten PLA2-Aktivität
eine Abnahme des PC-Gehaltes begleitet von der
Akkumulation des Abbauproduktes LPC während der
Keimung. Zusätzlich ergaben in vitro Analysen von
isolierten Lipidkörpern reifer Samen, dass die Bildung
von 13-HPOD durch die rekombinante CsLbLOX erst bei
gleichzeitiger Inkubation mit rekombinantem CsPAT
auftrat. Diese Experimente lassen vermuten, dass in
vivo die Mobilisierung der Speicherlipide durch die
Aktivität von CsPAT initiiert wird, welche den
partiellen Abbau der Lipidkörpermembran und damit die
Zugänglichkeit der LOX- bzw. TGL-Substrate
ermöglicht.Die transgene Expression von CsPAT und der CsLbLOX
in Tabaksamen führte nicht zu einem frühzeitigen Abbau
der Speicherlipide oder zu einer eindeutigen
Akkumulation von Lipidhydroperoxiden. Eine Beteiligung
an der Wundreaktion der transgenen Proteine in
Tabakblättern konnte ebenfalls nicht festgestellt
werden. Mittels Sequenzierung von Lipidkörperproteinen
wurde weder für Gurken- noch für Arabidopsis-Keimlinge
eine TGL-Sequenz identifiziert, welche als Kandidat für
den Abbau der Speicherlipide in Frage kam. Eine
ausreichende heterologe Expression der mutmaßlichen
keimungsspezifischen TGL AtTGL1 und AtTGL2 aus A.
thaliana in Insektenzellen und in P.
pastoris sowie der Nachweis der TGL-Aktivität
dieser Enzyme blieb bisher erfolglos, so dass keine
Rückschlüsse auf ihre physiologische Funktion gezogen
werden konnte.
Schlagwörter: Speicherlipidabbau; Lipoxygenase; Patatin-ähnliche Phospholipase; Lipidkörpermembran