Functional Characterization of the Histone Methyltransferase and Methyl DNA Binding Protein MDU and its Role in Epigenetic Regulation of Rbf Gene in Drosophila Melanogaster
Funktionelle Charakterisierung von Histon-Methyltransferase und Methyl-DNA-Bindeprotein MDU sowie seine Rolle bei der epigenetischen Regulierung des Rbf-Gens in Drosophila melanogaster
by Dawei Gou
Date of Examination:2008-10-30
Date of issue:2008-12-16
Advisor:Prof. Dr. Frank Sauer
Referee:Prof. Dr. Ernst A. Wimmer
Referee:Prof. Dr. Michael Kessel
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The methylation of genomic DNA and histones is paramount for the execution of epigenetic events such as imprinting, gene dosage compensation, and gene silencing. Studies in fungi, plants and vertebrates support a model in which histone methylation, in particular methylation of lysines 9 (H3K9) and/or 27 in histone H3, instigates de novo DNA methylation. However, little is known about the mechanisms mediating de novo DNA methylation in model organisms such as Drosophila melanogaster. Drosophila expresses key components of the DNA and histone machineries: a.) Histone methyltransferases of the SET-domain family (HMTs), which methylate H3K9 and play crucial roles in hetero-chromatin formation and maintenance and gene silencing; b.) One DNA methyltransferase (dDNMT2) which preferentially methylates CpA- and CpT-motifs in the Drosophila genome c.) Methyl-CpG binding domain (MBD) proteins, which potentially bind methylated DNA and convert DNA methylation into biological function. One member of the Drosophila MBD-protein family is MDU, which contains a MBD and SET-domain, which methylates H3K9 in vitro and in the fly, raising the possibility that MDU is involved in the H3K9 and DNA methylation machineries of the fly. In this thesis I have investigated the role of MDU in gene expression and DNA methylation. In vitro HMT-assays coupled Western blot and chromatin immunoprecipitation assays reveal that the SET-domain of MDU tri-methylates H3K9 in vitro and in vivo. MDU-mediated methylation of H3K9 facilitates trasncriptional repression of target genes in Drosophila cells, revealing that MDU mediates gene silencing. The MBD of MDU associates with methylated CpA-motifs in vitro, indicating that the MBD of MDU has intrinsic methyl DNA binding activity. Molecular and genetic data reveal that MDU represses the transcription of the tumor suppressor gene retinoblastoma family protein (Rbf), a key regulator of cell proliferation and differentiation. The dissection of the role of MDU in regulation of Rbf expression supports a mode l in which tri-methylation of H3K9 by MDU triggers dDNMT2-mediated de novo DNA methylation at an enhancer region of the Rbf locus. Once DNA methylation has been placed, the MBD of MDU associates with methylated DNA and induces a self-perpetuating histone-DNA methylation cascade that results in spreading of DNA and histone methylation along the Rbf locus and ultimately culminates in silencing of Rbf transcription. The obtained results uncover a role for the MBD/SET protein MDU in gene silencing, provide a mechanism for establishment of de novo DNA methylation in Drosophila, and imply that bifunctional MBD/SET proteins play important roles in the control of cell proliferation and differentiation in development.
Keywords: histone methyltransferase(HMT); Methyl-CpG binding domain (MBD) Protein; Drosophila melanogaster
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Die Methylierung der genomischen DNA und Histonen im
Kern eukaryotischer Zellen spielt eine wichtige Rolle
in epigenetischen Prozessen wie z. B. Imprinting, Gene
Dosage Compensation , und epigenetische Repression der
Genexpression. Studien in Pilzen, Pflanzen und
Vertebraten unterstützen ein Model, wonach die
Methylierung von Histonen, insbesondere die
Methylierung der Lysinreste 9 (H3K9) und/oder 27 im
Histon 3, die de novo Methylierung von DNA auslöst. Im
Gegensatz dazu, ist nur wenig über die Mechanismen
bekannt, die für de novo Methylierung in
Modelorganismen wie z. B. Drosophila melanogaster
verantwortlich sind. Drosophila exprimiert
Schlüsselfaktoren für die Methylierung von Histonen and
DNA: a.) Histonmethyltransferasen (HMT), die H3K9
methylieren und entscheidende Rollen für die
Etablierung and Aufrechterhaltung von Heterochromatin
und Genrepression spielen; b.) Eine
DNA-Methyltransferase (dDNMT2), die überwiegend CpA und
CpT-Motive im Drosophila Genom methyliert; c.)
Methyl-CpG binding domain (MBD) Proteine, die
methylierte DNA binden und DNA Methylierung in
biologische Aktivität übersetzen. Ein Mitglied der
Drosophila MBD-Proteinfamilie ist Medusa (MDU), welches
sowohl ein MBD- als auch ein SET-Motiv enthält. Das
SET-Motiv methyliert H3K9 in vitro und In Drosophila.
Die Anwesenheit eines MBD und Set Motivs in MDU
unterstützt die Hypothese, dass MDU an der Methylierung
von H3K9 und DNA in Drosophila beteiligt ist. In dieser
Arbeit habe ich die funktionale Beduetung von MDU
bezüglich der Genexpression and DNA Methylierung
untersucht. In vitro HMT-Experimente gekoppelt mit
Western blot and Chromatin
Immunpräzipitationsexperimenten ergaben, dass MDU H3K9
in vitro und in vivo tri-methyliert. MDU-vermittellte
Methylierung von H3K9 resultiert in Repression der
Zielgentranskription in Drosophila Zellkultur, woraus
abgeleitet werden kann, dass MDU als Repressor der
Transkription wirkt. Das MBD-Motiv von MDU bindet
methylierte CpA DNA Sequenzen in vitro, und besitzt
eine intrinsische methylierte-DNA Binding saffinität.
Die Ergebnisse molekularer and genetischer Studien
zeigen, dass MDU die Transkription des Tumorsuppressor
Gens retinoblastoma family protein (Rbf), einem
Schlüsselregulator der Zellproliferation und
differenzierung, reprimiert. Die Untersuchungen zur
Funktion von MDU in der Regulation der Expression von
Rbf unterstützen ein Model wonach tri-methylierung von
H3K9 durch MDU die dDNMT2-abhängige de novo
Methylierung in der cis-regulatorischen enhancer
Region von Rbf auslöst. Sobald DNA Methylierung
platziert ist, bindet das MBD-Motif von MDU an
methylierte DNA und induziert eine selbstangetriebene
DNA-Histone Mehtylierungskaskade, die zur Ausbreitung
von DNA und H3K9 Methylierung auf dem Rbf Genlocus
führt und letztendlich Repression der Rbf Transkription
bewirkt. Die Ergebnisse dieser Arbeit entschlüsseln die
Funktion von MDU in der Repression der Genexpression,
ergeben einen Mechanismus für die Etablierung der de
novo DNA Methylierung in Drosophila, und deuten auf
eine wichtige Rolle der bifunktionalen MBD/SET Proteine
für die Kontrolle der Proliferation und Differenzierung
von Zellen hin.
Schlagwörter: Histonmethyltransferasen (HMT); Methyl-CpG binding domain (MBD) Proteine; Drosophila melanogaster