Characterization of the 5-HT7(a) receptor: Specific receptor - G- protein interactions
Die Charakterisierung des 5-HT7(a) Rezeptor: das spezifische Rezeptor- G proteine Zusammenwirken.
von Elena Kvachnina
Datum der mündl. Prüfung:2004-04-29
Erschienen:2004-08-31
Betreuer:Prof. Dr. Evgeni Ponimaskin
Gutachter:Prof. Dr. Friedrich-Wilhelm Shürmann
Gutachter:Prof. Dr. Dr. Wolfgang Engel
Gutachter:Prof. Dr. Dietrich Gradmann
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Serotonin (5-hydroxytryptamine, or 5-HT) is very important neurotransmitter which regulates a variety of different physiological processes within the central Nervous System and at the periphery. Such effects are mediated through the large family of the specific 5-HT receptors. With the exception of the 5-HT3 receptor, all other 5-HT receptors belong to the family of G protein coupled receptors (GPCRs). Functionally, GPCRs act as biological switcher of branched network of signalling pathways by their interactions with heterotrimeric G-proteins. GPCRs are often subjected to the different post-translational modifications, which can modulate their activity and functions. One of such modifications is an attachment of 16-carbon fatty acid palmitate. Palmitoylation is unique between the post-translational modifications, because it is reversible and can be regulated. Functionally, palmitoylation of GPCRs can be involved in regulation of different processes including membrane targeting, interaction with G-proteins, basal and agonist-dependent activity as well as phosphorylation and desensitisation.In the present study we demonstrated that the 5-HT7(a) receptor undergoes post-translational palmitoylation. By combining both palmitate incorporation and pulse-chase techniques we found that [3H]-palmitate incorporation into the 5-HT7(a) receptor is dynamically changed after stimulation with agonist in dose-dependent and time-dependent manner. These effects were receptor-specific and did not represent metabolic effects.We also determined cysteine residues Cys404, Cys438 and Cys441 located in the carboxyl terminus of the receptor as potential palmitoylation sites. Surprisingly, by analysis of cysteine-deficient mutants we found that substitution of all three C-terminal cysteine residues did not completely abolish [3H]-palmitate incorporation, suggesting that the 5-HT7(a) receptor palmitoylation is not restricted to the carboxyl-terminal domain.Functional analysis revealed the critical role of the C-terminal palmitoylation for the modulation of receptor s constitutive activity. We also proposed a novel mechanism by which dynamic palmitoylation of proximal cysteine residue Cys404 may regulate both agonist-promoted and constitutive activity of the 5-HT7(a) receptor.In addition, we demonstrated for the first time that the serotonin 5-HT7(a) receptor is coupled both biochemically and functionally with Ga12 subunit of heterotrimeric G- protein. We further determined that the 5-HT7(a) receptor-mediated stimulation of Ga12 protein resulted both in RhoA-dependent neurite retraction and cell rounding as well as in Cdc42-mediated filopodia formation. These findings suggest the important role of serotonin in regulation of neuronal development in addition to its well-accepted function as neuromodulator.
Keywords: G-protein-coupled receptor; palmitoylation; functional activity; cell morphology regulation; signaltransduction
Weitere Sprachen
Serotonin (oder 5-HT) ist sehr wichtiger
Neurotransmitter, der verschiedene physiologische
Prozesse in des ZNS reguliert. Diese Effekten werden
durch die große Familie spezialer 5-HT Rezeptoren
vermittelt. Mit Ausnahme vom 5-HT3 Rezeptor, alle
anderen 5-HT Rezeptoren gehören zu der Familie von G
Proteine gekoppelten Rezeptoren (GPCR). Die CPGR dienen
als ein biologischer Schalter für das breites Netz von
Signalwegen durch ihre Interaktion mit heterotrimeren
G-Proteine. GPGR unterliegen oft verschiedenen
post-translationalen Modifikationen, die Rezeptor
Aktivitäten und Funktionen modulieren können. Eine von
dieser Modifikationen ist die Anknüpfung von 16 C
Fettsäure Palmitat. Palmitoylierung ist eine
einzigartige Modifikationen weil dies umkehrbar und
regulierbar ist. Palmitoylierung von GPGR ist in die
Regulation von verschiedenen Prozessen wie Lokalierung,
Interaktionen mit den G-Proteinen, sowie
Phosphorylierung und Desensitisierung.In dieser Studie wurde demonstrieren, dass der
5-HT7a Rezeptor palmitoiliert ist. Durch Kombination
zwischen time course und puls-chase Techniken haben
wir gezeigt, dass der [3H]- Palmitate-Einbau im 5-HT7a
Rezeptor durch die Stimulation mit dem Agonisten
dynamisch reguliert wird.Die C-terminalen Cysteinereste Cys404, Cys438 und
Cys441, wurden als potentialen Palmitoylierungsstellen
identifiziert. Dies wurde durch die ortspezifische
Mutagenese nachgewiesen. Darüber hinaus, haben wir
festgestellt, dass die Palmitoylierung nicht nur in den
Rezeptor C-terminus stattfindet. Funktionale Analyse
von acylierungdeffizienten Mutanten hat eine kritische
Rolle der C-terminale Palmitoylierung für die
konstitutive, agonisten-unabhängige Rezeptoraktivität
gezeigt. Wir haben auch ein neuer Mechanismus
vorgeschlagen, der die Regulation der
Rezeptoraktivitäten durch die dynamische
Palmitoylierung von Cys404 steuert.Außerdem konnten wir für den 5-HT7 Rezeptor
zusätzlich das G12-Protein als neue und bis jetzt noch
nicht beschriebene Rezeptor-Partner identifizieren. Die
Aktivierung des 5-HT7 Rezeptors führt zur
G12-vermittelten Stimulation der kleinen GTPasen RhoA
und Cdc42. In neuronalen Zellen löst die durch den
5-HT7 Rezeptor und G12-Protein initiierte, Cdc42- und
RhoA-gesteuerte Signalkaskade Wachstum der Neuriten und
die Abrundung der Zellen aus. Dies lässt vermuten, dass
Serotonin nicht nur als klassischer Neurotransmitter
wirkt, sondern auch in die Regulation der neuronalen
Architektur involviert ist.
Schlagwörter: G-proteine-gekoppelte Rezeptor; Palmitoylierung; funktionale Aktivität; die Regulation der Zellenmorphologie; Signalkaskade