Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie und Rasterkorrelationsmikroskopie molekularer Prozesse in Nervenzellen
Fluorescence correlation spectroscopy and scanning correlation microscopy of molecular processes within neurons
by Arne Gennerich
Date of Examination:2003-11-03
Date of issue:2003-11-14
Advisor:Prof. Dr. Dr. Detlev Schild
Referee:Prof. Dr. Werner Lauterborn
Referee:Prof. Dr. Dr. Detlev Schild
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Passive diffusion of molecules and active transport processes of organelles are of interest in many cellular systems. To understand how the intracellular milieu affects the diffusion of molecules in different parts of a cell, the diffusion of a dye-labeled dextran within the cytoplasm of cultured neurons of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles has been investigated using fluorescence correlation spectroscopy (FCS). During the course of this project, an instrument was built that combines the advantages of FCS and confocal laser scanning microscopy (CLSM). Furthermore, novel FCS- and CLSM-algorithms have been developed that allowed for the first time the study of diffusion processes of fluorescent molecules with high precision within small cytosolic compartments of neurons. With this setup and algorithms it was shown that fluorescence data from dendrites is best described by a model of anisotropic diffusion. As compared to diffusion in water, diffusion of a 10 kDa TMR-dextran along dendrites slows down by a factor of 1.1-2.1, whereas diffusion in the lateral direction is 10-100 times slower. The explanation for the observed anisotropy is most likely the dense intradendritic network of microtubules that is oriented parallel to the dendrite and thus hampers diffusion across the dendrite while leaving diffusion largely unaffected along the dendrite. In nuclei, diffusion was found to be isotropic in the three dimensions and 1.2-2.6 times slower than in water, indicating relatively unhampered diffusion in the nucleoplasm. In the second part of the project, the sub-microscopic organelle motility in dendrites of cultured neurons was investigated. In fluorescent microscopy, algorithms that allow both to localize organelles in living cells as a function of time and, at the same time, to determine parameters of their shape and size on a nanometer scale are at present not available. In this research project, two such algorithms based on convolution and correlation image analysis that take into account position, orientation, shape and size of the object being tracked, were developed and quantitatively compared by computer simulations. The developed finite particle tracking (FPT) algorithms were used to study sub-microscopic motility of dye-labeled mitochondria in dendrites. The data reveal a correlation between movement and sub-microscopic size-fluctuations of mitochondria. The observed simultaneous opposing displacements of the leading and trailing ends of the sausage-like structures might indicate that both microtubule plus- and minus-end directed motor proteins can act at the same time and thus distorting the shape and size of the transported mitochondria.
Keywords: laser scanning microscopy; fluorescence correlation spectroscopy; single particle tracking; finite particle tracking; diffusion; anisotropy; convolution; correlation; mitochondria; dendrites; neurons; microtubules; molecular motors
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Passive Diffusion von Molekülen und aktive
Transportprozesse von Organellen sind in vielen
zellulären Systemen von Interesse. Um zu verstehen, wie
das intrazelluläre Milieu die Diffusion von Molekülen
in verschiedenen zellulären Kompartimenten beeinflusst,
wurde die Diffusion eines mit Farbstoff markierten
Dextrans im Zytoplasma von kultivierten Neuronen aus
dem Bulbus olfactorius von Xenopus laevis Kaulquappen
unter Anwendung der
Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) untersucht.
Es wurde ein experimenteller Aufbau entwickelt, der die
Vorteile der FCS und der konfokalen
Laserrastermikroskopie (CLSM) vereint. Neue FCS- und
CLSM-Algorithmen wurden hergeleitet, die es zum ersten
Mal ermöglichten, Diffusionsprozesse von
fluoreszierenden Molekülen in kleinen zytosolischen
Kompartimenten von Neuronen mit einer hohen Präzision
zu untersuchen. Mit dem für dieses Projekt entwickelten
Gerät und den Algorithmen konnte gezeigt werden, dass
die Fluoreszenzdaten von Dendriten am besten durch ein
Modell für anisotrope Diffusion beschrieben werden. Im
Vergleich zu wässriger Lösung ist die Diffusion eines
10 kDa TMR-Dextran entlang der Achse eines Dendriten um
den Faktor 1.1 bis 2.1 verlangsamt, während die
Diffusion in lateraler Richtung um den Faktor 10 bis
100 reduziert ist. Die Erklärung für die beobachtete
Anisotropie ist sehr wahrscheinlich das intrazelluläre
Netzwerk von Mikrotubuli, das parallel zur
Fortpflanzungsrichtung des Dendriten ausgerichtet ist
und die Diffusion quer zur Dendritenachse stark
behindert, während es die Diffusion entlang des
Dendriten kaum beeinflusst. In Zellkernen wurde eine
isotrope Diffusion in allen drei Richtungen mit einer
1.2 bis 2.6fach reduzierten Diffusion im Vergleich zu
wässriger Lösung beobachtet. Die Diffusion innerhalb
der Zellkerne ist somit relativ ungehindert. In einem
zweiten Teil des Projektes wurde die submikroskopische
Mobilität von Organellen in Dendriten von kultivierten
Neuronen untersucht. In der Fluoreszenzmikroskopie
standen bis jetzt keine Algorithmen zur Verfügung, mit
denen sowohl Organellen in lebenden Zellen in
Abhängigkeit der Zeit lokalisiert als auch gleichzeitig
Form- und Größenparameter mit einer Genauigkeit bis zu
wenigen Nanometern bestimmt werden können. In diesem
Projekt wurden zwei solche Algorithmen basierend auf
der Faltungsprodukt- und Korrelationsanalyse von
Fluoreszenzbildern entwickelt, die sowohl Position,
Orientierung, Form und Größe der Objekte
berücksichtigen. Die Genauigkeit beider Algorithmen
wurde mit Hilfe von Computersimulationen quantitativ
untersucht. Die entwickelten "Tracking"-Algorithmen
wurden benutzt, um die submikroskopische Mobilität von
mit Farbstoff markierten Mitochondrien in Dendriten zu
untersuchen. Die Analysen zeigen eine Korrelation
zwischen Bewegung und submikroskopischer
Größenveränderungen von Mitochondrien. Die Beobachtung,
dass sich das vordere und das hintere Ende eines
Mitochondriums mitunter gleichzeitig in
entgegengesetzte Richtungen bewegen, könnte ein Hinweis
darauf sein, dass die entgegengesetzt gerichteten
Motorproteine Kinesin und zytoplasmatisches Dynein
gleichzeitig arbeiten können und somit zu Form- und
Größenveränderungen eines transportieren Mitochondriums
führen.
Schlagwörter: Laserrastermikroskopie; Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie; Diffusion; Anisotropie; Mitochondrien; Dendriten; Nervenzellen; Mikrotubuli; Faltung; Korrelation; molekulare Motoren