Entwicklung und Optimierung eines Cytometric Bead Arrays zum Nachweis von afrikanischen hämorrhagischen Fieberviren
Developement and optimization of a cytometric bead array for the detection of african hemorrhagic fever viruses
by Tamara Nordmann
Date of Examination:2012-04-24
Date of issue:2012-04-23
Advisor:Prof. Dr. Frank Torsten Hufert
Referee:Prof. Dr. Frank Torsten Hufert
Referee:Prof. Dr. Stefan Pöhlmann
Referee:Prof. Dr. Martin Oppermann
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Abstract
English
Viral hemorrhagic fevers (VHF) are acute infections with high infectivity and high case fatality rates. In most of the cases an effective vaccination or causal therapy does not exist or their availability is limited. Therefore hemorrhagic fever viruses (HFV) have a high risk of being used as biological warfare agents. During an outbreak the infection can spread rapidly so that huge amounts of samples need to be tested for HFV simultaneously. The established diagnostic methods of HFV are based on the combination of virus isolation, molecular (e.g. Real-time-PCR) and serological methods (e.g. ELISA). Nevertheless, a diagnostic tool to meet all requirements of the HFV-diagnostics in one tool does not exist. In this dissertation a Cytometric Bead Array (CBA) was therefore developed for the detection of eight of the most important african HFV: Lassa-Virus (LASV), Rift-Valley-Fever-Virus (RVFV), Crim-Congo-Hemorrhagic-Fever-Virus (CCHFV), Ebola-Zaire-Virus (EBOVZ), Ebola-Sudan-Virus (EBOVS), Marburg-Virus (MARV), Yellow-Fever-Virus (YFV), Dengue-Virus (DENV). For this purpose aminated virus-specific oligonucleotide probes were generated and conjugated to fluorescense-coded carboxy beads. The different african HFV were simultanously amplified by asymmetric reverse-transcription-multiplex-PCR using a biotiniyated reverse primer The biotinylated products of the multiplex-PCR were hybridized to the bead-coupled probes und subjected to subsequent detection in a flow cytometer. The analysis of the successful hybridization in the flow cytometer based on the detection of the streptavidin conjugated fluorescent reporter molecule Phycoerythrin attaching to the biotinylated PCR products. All eight african HFV were detected and specifically distinguished in uniplex-hybridization and in multiplex-hybridization. Cross-reactions were not observed. The determined analytic sensitivity of 10^4-10^5 molecules/ml for the multiplex assay ranged below the average viral load of a VHF-Infection on day 6 post-infection and can be compared with the sensitivity of a quantitative real-time-PCR. Consequently the CBA developed in this dissertation is an ideal method for HFV-diagnostics which is time-saving, highly specific, and shows high sensitivity and good reproducibility making high sample throughput possible while simultaneously detecting a whole spectrum of different HFV.
Keywords: viral hemorrhagic fevers; hemorragic fever viruses; cytometric bead array; flow cytometer; microbeads; multiplex-pcr
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Bei Viralen Hämorrhagischen Fiebern (VHF)
handelt es sich um akute Infektionen mit hoher Infektiösität und
hoher Letalität. Meist ist keine effektive Impfung oder kausale
Therapie vorhanden oder sie ist nur begrenzt verfügbar. Aus diesem
Grund besitzen viele der hämorrhagischen Fieberviren (HFV) auch ein
hohes Risiko als biologische Kampfstoffe verwendet zu werden. Bei
einem Ausbruch eines HFV kann es zur schnellen Verbreitung der
Infektion kommen, sodass in kurzer Zeit eine große Anzahl an Proben
auf mehrere HFV simultan getestet werden muss. Die etablierten
Diagnostikmethoden von HFV basieren auf der Kombination von
Virusisolation, molekularen (z.B. Real-Time‐PCR) und serologischen
Nachweisverfahren (z.B. ELISA). Dennoch gibt es bisher kein
diagnostisches Mittel um allen Anforderungen der HFV-Diagnostik
gleichzeitig gerecht zu werden. In dieser Dissertation wurde
deshalb ein Cytometric Bead Array (CBA) zum Nachweis der acht
wichtigsten afrikanischen HFV (Lassa-Virus, Krim-Kongo-Virus,
Rift-Valley-Fieber-Virus, Ebola-Zaire-Virus, Ebola-Sudan-Virus,
Marburg-Virus, Dengue-Virus und Gelbfieber-Virus) entwickelt.
Hierzu wurden aminierte virusspezifische Oligonukleotidsonden
generiert und kovalent an carboxylierte, fluoreszenz-codierte Beads
gekoppelt. Die verschiedenen afrikanischen HFV wurden simultan eine
asymmetrische Reverse-Transkriptase-Multiplex‐PCR amplifiziert, für
die zur späteren Detektion im Durchflusszytometer biotinylierte
Reverse-Primer verwendet wurden. Anschließend konnten die
biotinylierten Produkte der Multiplex‐RT‐PCR an die
Bead-gekoppelten Oligonukleotidsonden hybridisiert werden. Die
Analyse der erfolgreichen Hybridisierung am Durchflusszytometer
basierte auf dem Nachweis eines durch Streptavidin konjugierten
Fluoreszenzfarbstoffes, Phycoerythrin. In dem HFV-CBA aus dieser
Arbeit war es sowohl im Uniplex-Hybridisierungsverfahren als auch
im Multiplex-Hybridisierungsverfahren möglich alle acht HFV zu
detektieren und spezifisch zu unterscheiden. Kreuzreaktivitäten
wurden nicht beobachtet. Die analytische Sensitivität von 10^4-10^5
Moleküle/ml lag unter der durchschnittlichen Viruslast bei einer
VHF-Infektion am Tag 6. der Infektion und war damit vergleichbar
mit der Sensitivität quantitativer Real-time-PCR- Verfahren. Somit
ist der in dieser Arbeit entwickelte CBA ein ideales Verfahren zur
HFV-Diagnostik, das zeitsparend ist, eine hohe Spezifität und
Sensitivität sowie eine gute Reproduzierbarkeit aufweist und einen
hohen Probendurchlauf mit simultaner Detektion eines ganzen
Spektrums verschiedener HFV ermöglicht.
Schlagwörter: virale hämorrhagische Fieber; hämorrhagische Fieberviren; cytometric bead array; Durchflusszytometer; Mikrobeads; multiplex-PCR