Molekulare Charakterisierung des murinen 66.3-kDa-Proteins
Molecular characterization of the murine 66.3-kDa protein
by Florian G. Deuschl
Date of Examination:2008-12-11
Date of issue:2008-05-19
Advisor:Prof. Dr. Torben Lübke
Referee:Prof. Dr. Torben Lübke
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Description:Dissertation
Abstract
English
The mouse 66.3-kDa protein was identified as one of several putative novel lysosomal matrix proteins by analyzing mannose 6-phosphate receptors binding proteins (Kollmann K, Mutenda KE, Balleininger M, Eckermann E, von Figura K, Schmidt B, Lübke T (2005) Identification of novel lysosomal matrix proteins by proteome analysis. Proteomics 5(15), 3966–3678). The present work verifies the lysosomal localization of the endogenous 66.3-kDa protein by indirect immunofluorescence in mouse embryonic fibroblasts and by sub-cellular fractionation of tyloxapol-filled mouse liver lysosomes. The mouse 66.3-kDa protein expressed in HT1080 cells is synthesized as a precursor of 75kDa and subsequently processed by limited proteolysis to an N-terminal 28kDa and to a C-terminal 40kDa polypeptide which is further processed to a C-terminal 15kDa polypeptide. The 28kDa and 15kDa polypeptides accumulate in the lysosomal compartment. Northern blot analysis reveals high transcriptional levels in lung and testis, whereas Western blot analysis shows high protein levels in brain, lung, spleen and heart. Interestingly, in mouse the endogenous 66.3-kDa protein is processed in a highly tissue-dependent manner to mature forms. A possible function of the protein was investigated by affinity chromatography and interaction studies.
Keywords: 66.3-kDa protein; lysosomal protein; processing; transcription; protein expression
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Das murine 66.3-kDa-Protein wurde im
Rahmen einer Proteomanalyse Mannose-6-Phosphat-bindender Proteine
als eines von mehreren potentiell lysosomalen Matrixprotein
identifiziert (Kollmann K, Mutenda KE, Balleininger M, Eckermann E,
von Figura K, Schmidt B, Lübke T (2005) Identification of novel
lysosomal matrix proteins by proteome analysis. Proteomics 5(15),
3966–3678). In der vorliegenden Arbeit gelang es, die lysosomale
Lokalisation des endogenen 66.3-kDa-Proteins durch indirekte
Immunfluoreszenz embryonaler Mausfibroblasten und durch
subzelluläre Fraktionierung Tyloxapol-angereicherter Lysosomen aus
Leberhomogenat nachzuweisen. Das 66.3-kDa-Protein wurde in
HT1080-Zellen stabil exprimiert. Dort wird es durch limitierte
Proteolyse aus einer Proform von 75kDa in ein N-terminales
28-kDa-Fragment und ein C terminales 40-kDa-Fragment und
anschließend aus letzterem in ein C terminales 15-kDa-Fragment
prozessiert. Das 28-kDa- und das 15-kDa-Fragment konnten
intralysosomal nachgewiesen werden. Im Northern Blot konnte ein
hoher Transkriptionslevel in Lunge und Hoden und im Westernblot
eine hohe Proteinexpression in Gehirn, Lunge, Milz und Herz
detektiert werden. Interessanterweise wird das endogene murine
66.3-kDa Protein höchst gewebespezifisch in aktive Fragmente
prozessiert. Eine mögliche Funktion des Proteins wurde durch
Affinitätschromatographie und durch Interaktionsstudien
untersucht.
Schlagwörter: 66.3-kDa Protein; lysosomles Protein; Prozessierung; Transkription; Proteinexpression