Untersuchung des TGF-β-induzierten Zelltods in oligodendroglialen Kulturen
Analysis of TGF-beta-induced apoptosis in oligodendroglial cultures
von Ramona Schulz
Datum der mündl. Prüfung:2007-11-01
Erschienen:2008-02-12
Betreuer:Prof. Dr. Kerstin Krieglstein
Gutachter:Prof. Dr. Tomas Pieler
Gutachter:Prof. Dr. Ernst A. Wimmer
Gutachter:Prof. Dr. Gerhard Braus
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Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Apoptosis is controlled by complex networks with various interactions between different signalling pathways regarding to extracellular as well as intracellular signals. Thereby, the transforming growth factor (TGF)-β is integrated in diverse apoptotic signalling pathways dependent of the cell type, the cell context as well as the extracellular matrix. The multifunctional TGF-βs are also involved in cell migration, differentiation, proliferation and even in apoptosis. The TGF-β-induced apoptosis occurs in the development as well as in the adult organism in diverse tissues and organs. In the nervous system, TGF-βs have a critical role during the ontogenetic cell death. Therefore, the identification of TGF-β signalling pathways is an important exigence to clarify essential processes in the cell. Experiments with the murine, oligodendroglial cell line Oli-neu showed that TGF-β-induced apoptosis involves Smad activation and the activation of initiator as well as effector caspases, especially the caspase-8, -9 and -3, in this neural system. Further, the protein expression of the anti-apoptotic Bcl-2 family member Bcl-xl is reduced. In cooperation with TNF-α, the TGF-β-mediated apoptotic signalling cascade is increased. Further TGF-β-induced regulations are unknown in the oligodendroglial cell model Oli-neu. In this dissertation, main focuses were, on the one hand, specified analysis of the TGF-β-mediated Bcl-xl regulation and, on the other hand, analysis of the context dependence of TGF-β regarding to other cytokines. For the first main focus, we investigated in the most important antagonists of Bcl-xl, the BH3-only proteins via protein interaction analysis and expression analysis. However, the results excluded a classical regulation of BH3-only protein studied in TGF-β-induced apoptosis in Oli-neu cells. Therefore, we started interactome studies to search for new interaction partners of Bcl-xl. Mass spectrometric analysis revealed components of the cytoskeleton as possible Bcl-xl binding partners. Specified experiments identified that the 32kDa actin fragment namely Fractin bound to Bcl-xl. Caspase-2 as well as caspase-8 activation was involved in actin fragmentation into Fractin and was a prerequisite of Fractin-Bcl-xl binding. Further, the functionality of the cytoskeleton was essential in this novel regulatory mechanism shown by the actin function inhibitor cytochalasinD. Additionally, immunocytochemistry overexpression experiments with Bcl-xl and Fractin showed a clear colocalisation only in TGF-β-treated cells. Thereby, an overexpression of Fractin induced a decrease in Bcl-xl protein amounts but unaffected the apoptosis per se in Oli-neu cells. Such decrease in Bcl-xl protein amounts may lead to an imbalance of anti-apoptotic and pro-apoptotic factors on the mitochondria. The mechanism of the TGF-β-mediated actin fragmentation to regulate the Fractin-Bcl-xl interaction was undescribed until now and was also confirmed in primary oligodendroglial cultures in these studies. Further, this novel mechanism was dependent of the cell type and the apoptotic signal showing in TGF-β-treated lymphoma RamosB cells and with the general apoptosis inducer staurosprorine. The second project focussed the contextuality of TGF-β regarding to other cytokines involved in ontogenetic processes and apoptosis. In this dissertation, ActivinA, a member of the TGF-β superfamily, was discovered to initiate apoptosis in Oli-neu cells beside TGF-β. Further, apoptotic function of ActivinA in a neural system was undescribed until now (time: September 2007). In contrast to TNF-α, ActivinA did not cooperate with TGF-β in Oli-neu cells. A TGF-β release by ActivinA, and subsequent only a TGF-β-induced apoptosis, was also excluded and revealed two independent apoptotic pathways either by ActivinA or by TGF-β. Thus, the ActivinA-induced pathway was compared with the TGF-β-induced pathway to discover possible differences in these two apoptotic cascades. A first difference was showed in the regulation of the Bcl-2 family member Bcl-xl which protein amounts were unaltered by ActivinA treatment. In contrast to TGF-β, the classical caspase cascade was excluded since only initiator caspases such as caspase-2 and caspase-8 were activated in ActivinA-mediated apoptosis whereas effector caspase activation failed to appear. In ActivinA-mediated apoptosis, the apoptosis-specific DNA fragmentation occurred by the activation and translocation of the apoptosis inducing factor (AIF). The summation of differences between TGF-β-induced apoptosis and ActivinA-induced apoptosis confirmed the independence of these two pathways. Additionally, novel processes in ActivinA-mediated apoptosis were discovered concerning the apoptotic function of ActivinA in a neural system and the involvement of AIF in ActivinA-mediated processes.
Keywords: apoptosis; Bcl-2 family; ActivinA; TGF-beta; ontogensis; nervous system
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Die Apoptose wird durch multiple Signale,
integriert in komplexe Netzwerke, kontrolliert. Dabei treten
verschiedene Interaktionen zwischen vielfältigen, intrazellulären
Signalwegen in Bezug zu extrazellulären Reizen oder intrazellulären
Beschädigungen auf. In diesem komplexen System kann der
transformierende Wachstumsfaktor (engl.: transforming growth
factor, TGF)-β in verschiedene Signalwege integriert sein und zeigt
dabei seine starke Abhängigkeit vom Zelltyp, dem Zellkontext und
weiteren umgebenden Faktoren. Das Wirkungsspektrum der TGF-βs,
nicht nur in der Apoptose sondern auch im Zellwachstum, in der
Migration, in der Differenzierung und Proliferation von Zellen,
spiegelt die multifunktionelle Rolle dieser Zytokine wieder. Die
TGF-β-induzierte Apoptose tritt sowohl in der Entwicklung als auch
im adulten Organismus in vielen Organen auf, etwa zur Erhaltung der
Gewebshomeostase oder zur Entsorgung geschädigter, alter und
überflüssiger Zellen. Fehlfunktionen können zu schweren
Erkrankungen oder Fehlbildungen führen. In neuralen Systemen
spielen TGF-βs vor allem in den ontogenetischen Zelltodphasen eine
wichtige Rolle. Die Identifizierung der TGF-β-involvierten
Signalwege auf molekularbiologischer Ebene ist ein wichtiger
Schritt zur Aufklärung dieser fundamentalen Vorgänge in einer
Zelle.
An dem murinen, neuralen Modellsystem, die oligodendrogliale
Vorläuferzelllinie Oli-neu, wurde gezeigt, dass die
TGF-β-induzierte Apoptose über den Smad-Signalweg und die
Caspase-8, -9 und -3 geregelt wird. Des Weiteren wird die
Expression des anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedes Bcl-xl
verringert. Eine Behandlung der Oli-neu Zellen mit TGF-β und dem
Tumornekrose Faktor (TNF)-α führt zu einer Verstärkung der
apoptotischen Signalwege. Weitere Signalwege oder TGF-β-vermittelte
Regulationen sind nicht bekannt.
Die zwei Schwerpunkte dieser Doktorarbeit waren einerseits
Untersuchung zum Bcl-2 Familienmitglied Bcl-xl und dessen
TGF-β-induzierte Regulation, und andererseits Analysen zur
Kontextabhängigkeit von TGF-β im Bezug zu anderen Faktoren.
Im Zuge dieser Doktorarbeit wurden die häufigsten pro-apoptotischen
Antagonisten des Bcl-xl Proteins untersucht, die BH3-only Proteine.
Die Untersuchungen ergaben jedoch für keines der bekannten BH3-only
Proteine eine Regulation für Bcl-xl in der TGF-β-induzierten
Apoptose in Oli-neu Zellen. Daher wurde in einer Interactomstudie,
über einen GST-Pulldown, nach möglichen neuen Interaktionspartnern
von Bcl-xl gesucht. Massenspektrometrische Analysen
TGF-β-regulierter Kandidaten brachten Komponenten des Zytoskeletts
als Bcl-xl Interaktionspartner zum Vorschein. Genauere
Untersuchungen mittels Immunpräzipitationen zeigten eine Bindung
des geschnittenen N-terminalen 32kDa Aktinfragments Fraktin an
Bcl-xl auf. Die TGF-β-vermittelte Fragmentierung von Aktin in
Fraktin war dabei abhängig von den Caspasen-2 und -8 und einem
funktionstüchtigen Aktinzytoskelett. Die Fragmentierung in Fraktin
war zudem eine Grundvorrausetzung für die Bindung von Fraktin an
Bcl-xl. Somit ist die Fraktin-Bcl-xl Bindung ebenfalls abhängig von
den Caspase-2 und -8 und dem Aktinzytoskelett. CytochalasinD, ein
Inhibitor vieler Funktionen des Aktinzytoskeletts, konnte dabei die
TGF-β-induzierte Apoptose in Oli-neu Zellen reduzieren.
Überexpressionsexperimente mit Bcl-xl und Fraktin zeigten eine
eindeutige Kolokalisierung beider Faktoren in Folge einer TGF-β
Behandlung in immunzytochemischen Experimenten an. Dabei konnte
eine Überexpression von Fraktin alleine keine Apoptose in den
Oli-neu Zellen auslösen, bewirkte aber die Reduzierung der basalen
Bcl-xl Proteinmengen und sorgte so für ein Ungleichgewicht
anti-apoptotischer und pro-apoptotischer Faktoren am Mitochondrium.
Dieser bisher unbeschriebene Mechanismus der TGF-β-induzierten
Aktinfragmentierung und der regulierenden Fraktin-Bcl-xl Bindung
konnte an primären Oligodendrozytenkulturen bestätigt werden.
Versuche an der lymphozytären Zelllinie RamosB zeigten diese
TGF-β-vermittelten Regulationen nicht. Auch der allgemeine
Apoptose-induzierende Faktor Staurospor in konnte nicht die Bindung
von Fraktin an Bcl-xl in Oli-neu Zellen vermitteln. CytochalasinD
war ebenfalls nicht in der Lage die STS-induzierte Apoptose in
Oli-neu Zellen zu verringern. Somit ist die Bcl-xl regulierende
Bindung von Fraktin abhängig vom Zelltyp und dem Signal.
Letztendlich stellt die Fraktin-Bcl-xl Bindung eine wichtige und
neue Regulation des Bcl-2 Familienmitgliedes Bcl-xl in
apoptotischen Vorgängen dar.
Der zweite Schwerpunkt dieser Doktorarbeit waren Untersuchungen zur
Kontextabhängigkeit von TGF-β. D.h. es wurden Faktoren gesucht, die
neben TGF-β Apoptose in den Oli-neu Zellen auslösen können. Dabei
wurde ActivinA (ActA), ein weiteres Mitglied der TGF-β
Superfamilie, als Apoptose-auslösendes Zytokin ermittelt. Die
apoptotische Funktion von ActA in einem neuralen Modell war bis
jetzt (Stand: September 2007) nicht bekannt und erweitert die
apoptotische Funktionen von Activinen. Weitere Untersuchungen
ergaben, dass ActA keine Kooperation mit TGF-β eingeht. Die
ActA/TGF-β-vermittelten Apoptose zeigte keine Erhöhung der Anzahl
fragmentierter Zellkerne im Vergleich zu allein mit TGF-β oder ActA
behandelten Zellen. Die ActA Behandlung führte auch nicht zu einer
TGF-β Freisetzung. Daher wurde der ActA-vermittelte Signalweg
vergleichend zum TGF-β-vermittelten Signalweg weiter untersucht.
Die Analysen ergaben eine für die TGF-β Superfamilie typische
Smad-Aktivierung nach ActA Behandlung. Erste Unterschiede zeigten
sich bei der Überprüfung der Bcl-2 Familie und den Caspasen. Eine
Involvierung der Bcl-2 Familie in der ActA-induzierten Apoptose
konnte vorerst ausgeschlossen werden. Im Gegensatz zum
TGF-vermittelten Zelltod waren im ActA-induzierten Zelltod allein
die Initiatorcaspasen-2 und -8 signifikant aktiv. Effektorcaspasen
wie die im TGF-β Signalweg relevanten Caspasen-3 und -9 spielten
keine weiterleitende Rolle. Für die Kondensierung und
Fragmentierung der DNA in der ActA-induzierten Apoptose konnte der
Apoptose-induzierende Faktor (AIF) verantwortlich gemacht werden.
Eine Hemmung der Caspasen verhinderte den ActA-vermittelten und
AIF-involvierenden Zelltod und bestätigt damit neuere Studien, in
denen AIF in Abhängigkeit von der Caspaseaktivität freigesetzt
werden kann. Diese Summierung der Unterschiede in den
ActA-vermittelten und TGF-β-vermittelten Signalwegen zeigte
eindeutig die unterschiedlichen Signalweiterleitungen auf, in denen
zusätzlich zwei neue Pro zesse in Bezug zur ActA-induzierten
Apoptose auftraten. Einerseits wurde erstmals eine apoptotische
Funktion von ActA im Nervensystem gezeigt und andererseits eine
ActA-vermittelte AIF Aktivierung.
Schlagwörter: Apoptose; Bcl-2 Familie; ActivinA; TGF-beta; Ontogenese; Nervensystem