Strukturelle Charakterisierung der C-terminalen Domäne des spleißosomalen DExD/H-Box Proteins hPrp22

Abstract

Das Spleißen von prä-mRNA ist einer der dynamischsten Prozesse in der eukaryotischen Zelle. Neben den UsnRNAs ist eine Vielzahl von Proteinen am Spleißprozeß beteiligt. Einige dieser Proteine sind mobile Faktoren, während andere Komponenten integrale Bestandteile des spleißosomalen Komplexes sind. Die meisten dieser Proteine sind nicht direkt an der Entfernung der Introns und der Ligation der Exons beteiligt, sondern vermitteln Protein-Protein- bzw. Protein-RNA-Kontakte oder katalysieren Reaktionen, die zur internen Umlagerung des Spleißosoms führen. Eine am Spleißen beteiligte Proteinklasse sind die DExD/H-Box RNA-Helikasen. Sie können interne Basenpaarungen zwischen UsnRNAs oder UsnRNA-mRNA-Basenpaarungen entwinden. Ein Protein dieser Klasse ist das DEAH-Box Protein Prp22. Es wurde gezeigt, dass das homologe Protein yPrp22 aus Saccharomyces cerevisiae ATP-abhängige RNA-Helikase Aktivität zeigt, die zur Entwindung von RNA-Interaktionen zwischen U5 snRNP und mRNA führt. Dies führt zum Ablösen der reifen mRNA vom post-spleißosomalen Komplex. Nur die vollständig prozessierte genetische Information kann denn Zellkern verlassen und wird an den Ribosomen translatiert. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die dreidimensionale Kristallstruktur der C-terminalen Domäne des spleißosomalen DExD/H-Box Proteins hPrp22 (Aminosäuren 950 - 1183) aus Homo sapiens charakterisiert. Hierzu wurden die Phasen de novo mittels anomaler Dispersion von Brom und Selen bestimmt. Die Kristallstruktur birgt ein neues Faltungsmotiv. Basierend auf der Struktur der C-terminalen Domäne von hPrp22 wurden Modelle anderer homologer C-terminaler Domänen von hPrp2, hPrp16 und hPrp43 generiert. Durch diese Modelle konnten Aussagen über die Verteilung der Oberflächenladungen getroffen werden. Es zeigte sich, dass auf einer Seite der verschiedenen Domänen die Ladungsverteilung konserviert ist, während auf der gegenüberliegenden Seite signifikante Unterschiede erkennbar sind. Weiterhin wurden zahlreiche Deletionsmutanten von hPrp22 und hPrp2, einem weiteren spleißosomalen DExD/H-Box Protein, entworfen. Einige dieser verkürzten Proteinfragmente wurden gereinigt und auf ATPase-Aktivität untersucht. Dazu wurde ein enzym-gekoppelter photometrischer ATPase-Test angepasst. Die Absorptionsabnahme durch NADH-Verbrauch wird dabei bestimmt. Erste Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Anwesenheit der C-terminalen Domäne die ATPase-Aktivität von hPrp22 stimuliert.