Conformational state of monomeric kinesin UNC-104
Konformation des monomeren kinesin UNC-104
von Volker Christoph Henschel
Datum der mündl. Prüfung:2012-05-16
Erschienen:2012-11-06
Betreuer:Dr. Dieter Klopfenstein
Gutachter:Prof. Dr. Nils Brose
Gutachter:Prof. Dr. Andreas Wodarz
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Name:henschel.pdf
Size:5.67Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
The fast anterograde monomeric kinesin-3 motor UNC-104 is crucial for synaptic vesicle transport in neurons. in vitro, UNC-104 is a non-processive motor with biased-diffusional motion behaviour on a single molecule level. In contrast kinesin UNC-104 appears to be a fast motor in vivo. This leads to the hypothesis that in vivo the monomeric kinesin-3 may not act as single, monomeric motor but may dimerize when bound to cargo membranes. So the conformational state of UNC-104 during active (+)-directed motion in living organisms is still under debate. in vivo and in vitro studies in this thesis lead to the conclusion, that, in fact, UNC-104 can act as a dimeric motor in the neurons of living organisms. Previous in vitro studies suggest the neck coiled-coil region as the putative dimerization region (Tomishige et al., 2002, Klopfenstein et al., 2002). To investigate the role of the endogenous coiled-coils, point mutations in the neck coiled-coil are introduced, promoting either coiled-coil formation of kinesin-3 or reducing the likelihood of generating coiled-coils. Full length proteins are expressed in C. elegans neurons, and their truncated forms tested in in vitro assays. Only motors with high probability for coiled-coil formation in the neck coiled-coil region reach high transport velocities in vivo. Coiled-coil impairing mutants affect the control of muscle contraction in C. elegans and do not achieve velocities necessary for fast axonal transport in vivo. Dimer formation itself is tested in vivo by a newly developed system combining fluorescence anisotropy with spinning disc laser confocal microscopy, showing that coiled-coil promoting motors are more dimeric than WT motors in vivo. On the other hand coiled-coil impaired motors are more monomeric than WT motors in vivo and lead to decreased vesicle transport velocities. in vivo studies are supported by single-molecule measurements in vitro, indicating the same correlation of coiled-coil formation and velocity as given in the in vivo experiments, although Michalelis-Menten kinetics are indistinguishable in in vitro multi-motor gliding assays. Direct dimerization of WT and the coiled-coil promoting strains in vitro is evidenced by cross linking. The data show that kinesin-3 can act as a dimer in vivo and suggest a direct link between dimerization status and transport velocities.
Keywords: Kinesin; Fluorescence Anisotropy; dimerization; UNC-104
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Der sich anterograd fortbewegende kinesin-3 Motor UNC-104 ist esenziell für den Transport von synaptishen Vesikeln in neuronen. in vitro ist UNC-104 nicht protzessiv und zeigt ein Bewegungsmuster, das am ehesten als gerichtete Diffusion zu beschreiben ist. Andererseits zeigt kinesin UNC-104 in vivo aktiven und schnellen Transport seines Cargos .
Dieses Verhalten führ zur H-ypothese, dass der eigentlich monomere kinesin Motor in vivo nicht als einzelner und monomerer Motor in Erscheinung tritt, sondern möglicherweise dimerisiert, sobald er an sein Cargo bindet. Die Konformation des Motors in vivo während des aktiven Tranports wird aktuellen in unserem Forschungsfeld diskutiert.
Die in dieser Arbeit vorgenommenen in vivo und in vitro Experimente führen zum Schluß, dass Kinesin UNC-104 wirklich in vivo, in den Neuronen lebender Organismen, als Dimer vorkommen kann. Vorherige in vitro Experimente legten nahe, dass die neck coiled-coil Region diejenige sein könnte, in der die Dimerisierung stattfindet (Tomishige et al., 2002, Klopfenstein et al., 2002). Um die Rolle der coiled-coil Motive in diesem Prozess zu ermitteln wurden Punktmutationen in diesem Bereich manifestiert, die entweder die Möglchkeit der Formierung einer coiled-coil Struktur fördern, oder deren Bildung entgegenwirken.
Die mutierten Proteine wurden in voller Länge in neuronen von C. elegans expremiert. Identisch mutierte, aber verkürzten Proteine wurden aufgereinigt und in in vitro Assays getestet. Einzig allein Motoren, deren Fähigkeit zur coiled-coil Bildung erhöht ist, waren in vivo fähig die hohen Geschwindigkeiten während der Transportprozesse im Neuron zu erreichen. Die Proteine, deren Fähigkeit zur Bildung der coiled-coil Struktur beeinträchtigt ist konnten diese hohen Geschwindigkeiten nicht erreichen. Darüber hinaus zeigten die Mutanten, die Proteine in sich trugen, deren Fähigkeit zur Bildung der coiled-coil Struktur beeinträchtigt ist; Probleme bei der Muskelkontraktion.
Die Präsenz der Dimere in vivo wurde durch ein in dieser Arbeit entwickelten System nachgewiesen, das Fluoreszenz Anisotropie und Spinning Disc konfokale Laser Mikroskopie verbindet. Es zeigte sich, dass sich die Punktmutanten des Proteins deren Fähigkeit zur coiled-coil Bildung erhöht ist eher zu Dimeren zusammenschließen als die unveränderten Proteine. Umgekehrt konnte gezeigt warden, dass Punktmutanten des Proteins, deren Fähigkeit zur coiled-coil Bildung verringert ist, weniger zu Dimeren neigen als die unveränderten Proteine. Die in vivo Studien werden durch die Ergenisse unserer in vitro Experimente unterstützt, die auf Einzelmolekül-Messungen beruhen. Sie zeigen den identischen Zusammenhang zwischen der Fähigkeit zur Bildung einer coiled-coil Struktur und dem Erreichen für den Organismus lebenswichtigen hohen Geschwindigkeit der Transportproteine und das obwohl deren Michalelis-Menten Kinetik in in vitro multi-motor gliding Assays nicht unterschiedlich. Der direkte Nachweis einer Interaktion zum Dimer konnte sowohl beim unveränderten Protein, als auch bei den Proteinen des Proteins deren Fähigkeit zur coiled-coil Bildung erhöht ist, durch cross linking erbracht werden.
Die Experimente zeigen eindeutig, dass kinesin-3 in vivo als Dimer vorliegen kann und zeigen zusätzlich einen direkten Zusammenhang zwischen dem Dimerisierungsstatus und den Tansportgeschwindigkeiten des Proteins.
Schlagwörter: Kinesin; Fluoreszenz Anisotropie; Dimerisierung; UNC-104