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Improvement of Winter Oilseed Rape Resistance to Verticillium longisporum - Assessment of Field Resistance and Characterization of Ultrastructural Plant Responses

dc.contributor.advisorTiedemann, Andreas von Prof. Dr.de
dc.contributor.authorKnüfer, Jessicade
dc.date.accessioned2013-07-04T10:53:12Zde
dc.date.available2013-07-04T10:53:12Zde
dc.date.issued2013-07-04de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0001-BAA5-Ade
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-3920
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-3920
dc.description.abstractDie Intensivierung des Rapsanbaus in den letzten Jahren hat zu einem verstärkten Aufkommen des bodenbürtigen Gefäßpathogens V. longisporum geführt. Die für den Pilz charakteristischen Mikrosklerotien können langjährig im Boden überdauern, akkumulieren und somit zur fortdauernden Bodenkontamination führen. Eine Infektion mit V. longisporum kann bereits im Herbst erfolgen, wenn durch Wurzelexsudate stimulierte Mikrosklerotien auskeimen und direkt die Wurzelepidermis der Rapspflanze penetrieren. Einer sowohl intra-als auch interzellulär gerichteten Ausbreitung bis zu den Gefäßelementen schließt sich eine langanhaltende Phase des Pilzes im Gefäßsystem an. In dieser latenten Phase zeigen sich keine auffälligen Symptome an der Pflanze, erst zum Ende der Pflanzenentwicklung zeigt sich halbseitige Stängelverbräunung und vorzeitige Abreife kann zu Ertragseinbußen führen. Der Pilz bleibt so lange auf die Gefäße beschränkt bis die Pflanze in die Seneszenzphase eintritt. Dann erfolgt eine Besiedelung der angrenzenden parenchymatischen Zellen und die Bildung von Mikrosklerotien. Mit Pflanzenresten können diese wieder in den Boden gelangen. Da derzeit keine adequaten Pflanzenschutzmittel zur Verfügung stehen, ist der Anbau resistenter Sorten eine wirkungsvolle Maßnahme die Verbreitung des Pilzes einzudämmen und der Anreicherung von Mikrosklerotien im Boden entgegenzuwirken. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein entscheidender Beitrag zur Züchtung neuer resistenter Genotypen geleistet. Phänotypisierungen zur Identifizierung resistenter B. napus-Linien (darunter auch DH-Linien) erfolgten unter kontrollierten Bedingungen im Gewächshaus in Göttingen. Darüber hinaus wurde die Resistenz ausgewählter B. napus-Linien in zwei aufeinander folgenden Jahren anhand von Feldversuchen in Göttingen, an verschiedenen Standorten in Norddeutschland und an einem Standort in Südschweden evaluiert. Eine Untersuchung der von 2004 bis 2009 im Gewächshaus getesteten B. napus Akzessionen wurde hinsichtlich der Häufigkeitsverteilungen der berechneten normierten AUDPC-Werte betrachtet. So konnte deutlich gezeigt werden, dass sich das Resistenzlevel in den aktuellsten Screenings deutlich verbessert hat im Vergleich zum Beginn der Screenings. Die Reproduzierbarkeit der Screenings wurde deutlich durch die Betrachtung der normierten AUDPC-Werte der Referenzsorten ‘Falcon’ und ‘Express’. So waren die normierten AUDPC-Werte der mittelgradig resistenten Referenzsorte ‘Express’ durchgängig niedriger im Vergleich zu der anfälligen Sorte ‘Falcon’, was für die Robustheit der Methodik spricht. Der Vergleich zwischen Gewächshaus- und Feldversuchen zeigte, dass eine geringe Korrelation zwischen den im Feld und Gewächshaus getesteten Akzessionen besteht und macht die Komplexität der Untersuchungen deutlich. Ein Screening von Genotypen kann jedoch nur schnell und in großem Umfang unter Gewächshaus-Bedingungen erfolgen. Die erweiterte Testung im Feld ist dann jedoch nötig, um die Resistenz unter zusätzlichem abiotischem Stress zu evaluieren. Neben der Bewertung des Befallsgrades (Befallshäufigkeit, Befallsstärke) mittels Stoppelbonitur wurde eine alternative Bewertungsmethode zur Evaluierung der Resistenz im Feld kultivierter Rapspflanzen gegenüber V. longisporum entwickelt. Die Entwicklung einer sensitiven real-time PCR (qPCR)-Methode zur Detektion von V. longisporum in Rapsstängeln beinhaltete die Bewertung zweier unterschiedlicher Primer, abzielend auf die internal transcribed spacer (ITS) Region bzw. auf die β-Tubulin-Region, die hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität analysiert wurden. Die hier getesteten ITS-Primer wiesen eine hohe Sensitivität gegenüber genomischer Pilz-DNA auf, jedoch wurde keine Spezifität gegenüber V. longisporum Isolaten festgestellt; vielmehr wurden V. dahliae Isolate und zwei weitere Verticillium Arten mit ITS-Primern detektiert. Das zweite getestete Primerpaar zeigte hingegen eine hohe Spezifität gegenüber V. longsiporum Isolaten, lediglich 3 von 15 getesteten V. longisporum Isolaten wurden nicht erfasst. Die Sensitivität dieser Primer war jedoch im Vergleich zu den ITS-Primern stark verringert. Die ITS-basierte qPCR Analyse führte zur Detektion des Pathogens noch vor der Symptomausbildung im Feld. So konnte in der Saison 2008/09 am Standort Göttingen gezeigt werden, dass frühe Infektionen bereits zu BBCH 65 auftraten und innerhalb weniger Wochen eine massive Besiedelung anfälliger Sorten erfolgte. Zudem konnte die pilzliche DNA-Konzentration in infizierten Rapsstängeln verschieden anfälliger Sorten quantifiziert und eine Korrelation zwischen der herkömmlichen Stoppelbonitur und dem Screening im Gewächshaus hinsichtlich der Einordnung der Resistenzniveaus hergestellt werden. Dies unterstützt die Verwendung der molekularen Methode als Alternative zur Stoppelbonitur. Neben der Verbesserung der Detektion von V. longisporum im Feld wurde die Pathogen-Wirt-Interaktion hinsichtlich der Ausbildung von Resistenzmechanismen charakterisiert. Dazu wurden zwei verschieden anfällige B. napus-Linien nach Inokulation mit V. longisporum sowohl auf histologischer als auch auf molekularbiologischer Ebene im Hypokotylbereich untersucht. Dieser Abschnitt, der den Bereich vom Wurzelhals bis zum Keimblattansatz markiert, konnte in vorangegangenen Untersuchungen als Schlüsselgewebe für die Ausbildung von Resistenzstrukturen identifiziert werden (Eynck et al., 2009). Anknüpfend an diese Untersuchungen wurden mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) genotypabhängige Resistenzstrukturen wie Gefäßverschlüsse und morphologische Veränderungen des Gefäßbereiches untersucht und begleitende qPCR-Messungen dokumentierten die Pathogenausbreitung. Diese ließen erkennen, dass der anfällige Genotyp im Vergleich zum resistenten Genotyp schneller besiedelt wird. Jedoch zeigten beide mit V. longisporum inokulierten Genotypen ähnliche ultrastrukturelle Veränderungen im vaskulären Bereich. So konnten Veränderungen an vaskulären Zellwänden wie elektronendichte Ablagerungen und Degradation primärer Zellwände im Bereich der Tüpfel beobachtet werden. Zudem konnte das Verschließen von Gefäßelementen mittels gelartiger Strukturen nachgewiesen werden. Unsere Untersuchungen lassen vermuten, dass der resistente Genotyp fähig ist Infektionen schneller zu erkennen und Resistenzmechanismen zielgerichteter und intensiver zu aktivieren. Da eine V. longisporum-Infektion in dem untersuchten resistenten Genotyp SEM 05-500256 u. a. zu einer verstärkten Bildung von Gefäßbarrieren im Hypokotylbereich führt (Eynck et al., 2009), wurde eine Beeinträchtigung des pflanzlichen Wassertransportes vermutet. Zur Klärung dieser Frage wurde der resistente Genotyp zusätzlich zu einer Infektion mit V. longisporum Trockenstressbedingungen (30% Feldkapazität) ausgesetzt und physiologische Parameter (Gaswechselmessungen), Befallswerte (AUDPC, Stauchung) und agronomische Parameter (Phänologisches Entwicklungsstadium, Anzahl Seitentriebe, Ertragsparameter) erfasst und im Vergleich zu der anfälligen Sorte ‘Falcon’ evaluiert. Weder die Befallsparameter noch die agronomischen Parameter zeigten eine Beeinträchtigung der Resistenz von SEM bei V. longisporum-Infektion in Kombination mit Trockenstress an.de
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/
dc.subject.ddc630de
dc.titleImprovement of Winter Oilseed Rape Resistance to Verticillium longisporum - Assessment of Field Resistance and Characterization of Ultrastructural Plant Responsesde
dc.typedoctoralThesisde
dc.contributor.refereeKarlovsky, Petr Prof. Dr.de
dc.date.examination2011-07-21de
dc.description.abstractengRecent years have seen an intensification of oilseed rape (OSR) cultivation, which, together with shorter crop rotations has led to a rapid increase in infestation by the soil-borne vascular pathogen V. longisporum. The fungus forms survival structures, termed microsclerotia, that can accumulate in the soil and thereby lead to persistent contamination. An infection by V. longisporum can already occur in autumn, when root exudates stimulate microsclerotia to germinate, after which hyphae grow towards the roots and penetrate the root epidermis of the OSR plant. The intra- and intercellular spread of the fungus towards the vessel elements is followed by a latency period within the vascular system. While initially plants do not show prominent symptoms during this latency period, half-sided discoloration of stems emerges towards the end of plant development and premature senescence can cause significant yield losses. The fungus remains restricted to the vascular system until the plant enters the senescence phase. This transition initiates the colonization of adjacent parenchyma cells and the formation of microsclerotia, which can be recycled into the soil together with plant debris. Since presently fungicides remain elusive, cultivation of resistant cultivars is an efficient measure to curb fungal spread and to counteract accumulation of microsclerotia in the soil. This thesis provides a vital contribution to the breeding efforts for novel resistant B. napus genotypes. For identification of resistant B. napus cultivars (including DH lines), phenotypisation was performed under controlled greenhouse conditions in Göttingen. In addition, the resistance of selected B. napus lines has been assessed during two consecutive years under natural environmental conditions at several field sites in Nothern Germany and one field site in Southern Sweden. Greenhouse screenings of B. napus accessions tested between 2004-2009 were analyzed with respect to the frequency distribution of calculated, normalized AUDPC values. It could be explicitly demonstrated that the resistance level in the most recent screening had significantly improved compared to the first screenings. Consistency in normalized AUDPC values of reference cultivars ‘Falcon’ and ‘Express’ confirmed the reproducibility of the screenings. The robustness of the method is reflected in the normalized AUDPC values of the reference accessions, which were consistently lower for the moderately resistant cultivar ˈExpressʼ compared to those of the susceptible cultivar ‘Falcon’. A comparison of greenhouse and field experiments reveals a moderate correlation between accessions tested under controlled or field conditions and illustrates the complexity of these studies. Greenhouse experiments are indispensable for a rapid and comprehensive screening of a large number of genotypes. However, the transition to field trials is ultimately necessary to evaluate resistance under environmental conditions that can cause additional abiotic stress. Parallel to the assessment of the infestation level (disease incidence and severity) by stubble screening, an alternative approach for evaluation of resistance of OSR plants under field conditions was established. The development of a sensitive real-time PCR (qPCR) method for the detection of V. longisporum in rapeseed stems comprised the evaluation of two different primer pairs targeting either the internal transcribed spacer region (ITS) or beta-tubulin region, with respect to their sensitivity and specificity. The ITS primers showed high sensitivity for fungal genomic DNA, but were poor in their specificity towards V. longisporum isolates. Rather, apart from V. longisporum these primers also similarly detected V. dahliae isolates and two additional Verticillium species. In contrast, the tubulin primers also evaluated in this study showed high specificity towards V. longisporum and failed to detect only 12 out of 15 tested isolates. However, the sensitivity of these tubulin primers was strongly reduced by a factor of 2E14 compared to the ITS primers. Application of ITS-based qPCR permitted the detection of the pathogen before emergence of symptoms in the field. It could be demonstrated during the season 2008/2009 that early infections already occurred at BBCH 65 and within a few weeks resulted in massive colonization of susceptible cultivars. Moreover, it was possible to quantify fungal DNA concentrations in infected rapeseed stems of cultivars of varying susceptibility, and to demonstrate that these concentrations correlate with the traditional stubble screening in field trials and the phenotypic greenhouse screening with respect to the classification into resistance classes. These results support the application of the molecular method for disease diagnostics as an additional method to the traditional stubble screening. Apart from the improvement of field-based detection methods for V. longisporum, detailed studies of the host-pathogen interaction were performed to characterize the formation of resistance mechanisms. For this purpose, the hypocotyl sections of two differently susceptible B. napus lines were investigated at the histological and molecular level after inoculation with V. longisporum. Previous studies have identified the hypocotyl, which marks the segment from the root crown to the cotyledon, as the key tissue for the formation of resistance structures (Eynck et al. (2009)). Building on these studies, genotype-specific resistance structures such as vessel occlusions and morphological changes of the vascular system were investigated by transmission electron microscopy (TEM) and, in parallel the spread of the pathogen was monitored by qPCR. Although qPCR results demonstrated a markedly accelerated colonization of the susceptible genotype compared to resistant genotype, both genotypes revealed similar ultrastructural changes of the vascular system upon infection by V. longisporum. These morphological changes included alterations of cell walls such as electron-dense depositions and degradation of primary cell walls in pit areas. It was further shown that infection leads to occlusion of vessel elements by gel-like structures. Our studies suggest that, in order to elicit a targeted resistance response, the resistant genotype is able to recognize infection more rapidly and to activate defense mechanisms more efficiently. The increased formation of vessel occlusions in the hypocotyl segment in the resistant genotype SEM 05-500256 upon infection by V. longisporum (Eynck et al., 2009) suggested that these resistance structures might affect the water transport system of the plant. To clarify this point, the resistant genotype was subjected to drought stress (30% field capacity) in addition to infection by V. longisporum and physiological parameters (gas exchange) as well as infestation levels (AUDPC, stunting) and agronomic parameters (phenological growth stages, number of branches and yield parameters) were evaluated and compared to the performance of the similarly treated, susceptible cultivar ‘Falcon’. Neither infestation parameters nor agronomic parameters revealed indications of compromised resistance of V. longisporum-infected SEM in combination with drought stress.de
dc.contributor.coRefereeBecker, Heiko C. Prof. Dr.de
dc.subject.engOilseed rapede
dc.subject.engVerticillium longisporumde
dc.subject.engresistance breedingde
dc.subject.engquantitative real-time PCRde
dc.subject.engelectron microscopyde
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-11858/00-1735-0000-0001-BAA5-A-9de
dc.affiliation.instituteFakultät für Agrarwissenschaftende
dc.subject.gokfullLand- und Forstwirtschaft (PPN621302791)de
dc.identifier.ppn751154504de


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