Etablierung, Validierung und Anwendung einer gaschromatographisch-massenspektrometrischen Methode zur Analyse von Testosteron und 17α-OH-Progesteron im Serum

Methodenvergleich der GC-NCI-MS-Methode mit dem Siemens ADVIA Centaur Immunoassay der Testosteronanalyse

Establishment, validation and application of a GC-MS method for the analysis of testosterone and 17α-OH-progesterone in serum

Method comparsion of GC-NCI-MS and Siemens ADVIA Centaur Immunoassay for testosterone analysis

by Liligret Valerie Schön
Doctoral thesis
Date of Examination:2013-09-03
Date of issue:2013-09-03
Advisor:Prof. Dr. Nicolas von Ahsen
Referee:Prof. Dr. Hubertus Jarry
Referee:Prof. Dr. Martin Oppermann
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-4003

 

 

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Abstract

English

Objective: The objective of this study was to develop and validate a robust, specific and sensitive electron capture negative ionization gas chromatography-mass spectrometry method (GC-NCI-MS) to quantify serum testosterone and 17α-OH-progesterone. Method comparison was provided with Siemens ADVIA Centaur Immunoassay for testosterone analysis. Insufficient accuracy and sensivity of steroid hormone analysis with immunoassays, especially for analysis of low steroid hormone concentrations for testosterone, i.e. in women and children, provided incentive for this study. Methods: The GC-NCI-MS method involves the addition of deuterium labeled standard to 1 ml serum, liquid-liquid-extraction with ethyl acetate and a clean-up with solid phase extraction. The residues are transformed to pentafluorobenzyl/trimethylsilyl derivatives which can be injected into GC-MS. This procedure shows excellent chromatograhic separation. Testosterone and 17α-OH-progesterone are quantified by selected ion monitoring, measuring peak ratios of analyte and internal standard. Serum testosterone concentrations were measured in 10 men and 20 women and children with the GC-MS method and then with Siemens ADVIA Centaur Immunoassay for method comparison. Results: Excellent correlation (r= 0,97) between the two assays was shown in physiological testosterone concentrations for men (2,6 -9,2 ng/ml). Poor agreement (r= 0,77) was shown in lower testosterone concentrations which are found in children and women (0,05-0,51 ng/ml). In this range, testosterone concentrations measured by the immunoassay were biased toward higher values (mean difference 158,9 %). Conclusion: The method comparison underlines the problematic analysis with immunoassays. Differences to massspectrometry methods, which are seen as reference methods in steroid hormone analysis, are explained by cross-reactivity, poor sensitivity in low concentrations and lack of validation of immunoassays. Immunoassays are not sufficiently reliable for steroid hormone analysis for children and women, where low concentrations of serum testosterone are expected. Therefore, preference for mass spectrometry methods should be given in the analysis of serum testosterone concentrations.
Keywords: method validation; gaschromatography-mass spectrometry; method comparison; immunoassay; endocrinology; steroid hormones

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Ziele: Die Arbeit hatte die Etablierung und Validierung einer robusten, spezifischen und sensitiven GC-NCI-MS Methode zum Ziel, um Testosteron und 17α-OH-Progesteron im Serum zuverlässig quantifizieren zu können. Anschließend wurde die Methode mit dem Siemens ADVIA Centaur Immunoassay zur Testosteronanalyse verglichen. Hintergrund der Arbeit ist die mangelnde Richtigkeit und Sensitivität der Steroidhormonanalyse mit Immunoassays, inbesondere bei Hormonanylsen in geringen Konzentrationen, wie z.B. Testosteron bei Frauen und Kindern. Methode: Die Methode umfasste die Zugabe von deuterierten Internen Standard zu 1 ml Serum, gefolgt von Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Ethylacetat und einem Clean-up mittels Festphasenextraktion. Die angereicherten und aufgereinigten Proben können mit Pentafluor¬benzyl¬hydroxylamin-hydrochlorid und MSTFA/TMCS (99:1) erfolgreich derivatisiert und im Anschluss in die GC-MS injiziert werden. Die Methode zeigt eine exzellente chromatographische Trennung. Testosteron und 17-OH-Progesteron wurden im Selected Ion Monitoring detektiert, die Quantifizierung erfolgte durch den Vergleich der Verhältnisse der Peakflächen zwischen Internen Standard und Analyten. Für den Methodenvergleich, zwischen der GC-MS Methode und dem Siemens ADVIA Centaur Immunoassay, wurde Testosteron in 10 Proben von Männern und 20 Proben von Kindern und Frauen analysiert. Ergebnisse: In dem für Männer physiologischen Konzentrationsbereich (2,62 -9,29 ng/ml) konnte eine sehr gute Übereinstimmung der Analysenergebnisse beider Methoden gezeigt werden (r= 0,97). Im Gegensatz dazu fiel im niedrigen Konzentrationsbereich aus Seren von Frauen und Kindern (0,05 - 0,51 ng/ml) eine geringe Übereinstimmung (r= 0,77) der Messergebnisse auf, wobei hier mit dem untersuchten Immunassay im Mittel um 158,9 % höhere Konzentrationen erzielt wurden. Schlussfolgerung: Der Methodenvergleich spiegelt die aktuelle Problematik in der Testosteronanalytik wider. So werden Messdifferenzen zu massenspektrometrischen Referenzmethoden auf eine mangelnde analytische Spezifität und Sensitivität, als auch ungenügende Validierung der Immunoassays zurückgeführt. Wenn niedrige Konzentrationen erwartet werden, wie bei der Testosteronanalyse in Serum von Frauen und Kindern, oder wenn zweifelhafte Analysenergebnisse vorliegen, sollte auf massenspektrometrische Referenzmethoden zurückgegriffen werden.
Schlagwörter: Gaschromatographie-Massenspektrometrie; Methodenvergleich; Methodenvalidierung; Endokrinologie; Immunoassay; Steroidhormone
 
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