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Studies on Ramularia Leaf Spots on Barley - Resistance Phenotyping, Epidemiology and Pathogenicity

dc.contributor.advisorTiedemann, Andreas von Prof. Dr.
dc.contributor.authorZamani-Noor, Nazanin
dc.date.accessioned2013-10-31T09:27:20Z
dc.date.available2013-10-31T09:27:20Z
dc.date.issued2013-10-31
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0001-BC13-F
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-4115
dc.description.abstractRamularia collo cygni (Rcc), der Erreger der Sprenkelkrankheit an Gerste, gewinnt zunehmend an Bedeutung. Das pilzliche Pathogen wird den Deuteromyceten zugeordnet. Typisch für die Krankheit ist ein auffallend spätes Auftreten von Symptomen in der Vegetationsperiode. Nach Abschluss der Blüte nimmt die Befallsstärke stark zu, was sich in einer Verbräunung und Absterben der Blätter innerhalb von 12 Tagen zeigt. Klassische Untersuchungsmethoden der Rcc-Gerste-Interaktion werden kontinuierlich durch molekulare Untersuchungen zur Befallsdynamik unterstützt. So stehen seit kurzem PCR-basierte Verfahren zum Nachweis von Rcc in Pflanzengewebe zur Verfügung. Ziel dieses Projektes waren Untersuchungen zur Epidemiologie und Pathogenität von Rcc, weiterhin wurde die Herkunft des Inokulums und die Verbreitung des Pathogens untersucht. Ein weiterer Schwerpunkt war die Entwicklung von robusten Phänotypisierungs-Assays zur Bewertung der Resistenz unterschiedlicher Gersten-Genotypen sowohl unter Gewächshaus- als auch unter Feldbedingungen. Zunächst wurde eine auf SYBR-Green basierende quantitative Real-Time PCR (qPCR)-Methode zum Nachweis von pilzlicher DNA in Pflanzengewebe entwickelt. Die Nachweisgrenze der pilzlichen DNA lag hier bei 0,1 pg in Flüssigkultur, sowie in Pflanzengewebe und in Samenmaterial; auch in Regenwasser und Schnee konnte diese DNA-Konzentration noch nachgewiesen werden. Mittels qualitativer PCR konnte eine Übertragung des Pathogens von Samen auf Keimlinge gezeigt werden. Die Untersuchungen bestätigten auch, dass die weitere Ausbreitung des Pathogens in älteren Pflanzen ohne Ausbildung von Symptomen erfolgte. Unter Gewächshausbedingungen traten in infizierten Pflanzen erste Symptome erst zur Abreife und Kornentwicklung auf. Eine Desinfektion der Samen mit heißem Wasser führte nicht zur Abtötung von Rcc und somit zur Verbreitung des Pathogens in der Pflanze. In weiteren Untersuchungen wurde die Wirkung von Saatgutbehandlung und Blattfungiziden zu unterschiedlichen Entwicklungsstadien der infizierten Pflanze getestet. Die Beizmittel Zardex G (Cyproconazol und Imazalil) und das systemische Blattfungizid Proline (Prothioconazole) wurden zu unterschiedlichen Wachstumsphasen der Pflanze appliziert und die Verbreitung von Rcc mittels Real-Time PCR analysiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Fungizide bei separater Anwendung keine Wirkung hatten, eine Kombination der beiden Pflanzenschutzmittel jedoch Effekte zeigte. So konnte nach Beizung mit Zardex G und anschließender Anwendung von Proline im Wachstumsstadium 39-41 ein starker inhibitorischer Effekt auf das pilzliche Wachstum demonstriert werden. In einer weiteren Studie wurde die Verbreitung und Mobilität von Rcc Inokulum über die Luft mittels Sporenfallen untersucht, die entweder in der Nähe eines Gerstenfeldes oder weiter enfernt aufgestellt wurden. Im späten Herbst und in den Wintermonaten wurden Sporen von Rcc in größerer Entfernung von Gerstenfeldern und in höheren Lagen nachgewiesen. Rcc Inokulum ist demnach weit verbreitet und kann auch über größere Distanzen durch die Luft, im Regenwasser oder Schnee transportiert werden. Interessanterweise ist Inokulum auch auch in kühleren Jahreszeiten nachweisbar. Zur Identifizierung resistenter Genotypen erfolgten Phänotypisierungen von Blattsegmenten in der Klimakammer und parallel dazu wurden Screenings unter Feldbedingungen im Reifestadium 73-75 durchgeführt. Es konnten signifikant unterschiedliche Anfälligkeiten gegenüber Rcc sowohl im Feld, als auch unter kontrollierten Bedingungen im Gewächshaus und der Klimakammer gezeigt werden. So konnten einige Genotypen identifiziert werden, die besonders gute Resistenzen aufwiesen wie z. B. die Sorte IPZ 24727. Eine signifikante Korrelation konnte zwischen den Gewächshausdaten (Inokulation ganzer Pflanzen) und den Felddaten 2009 (p=0,005, rs=0,483) und 2010 (p=0,03, rs=0,384) nachgewiesen werden. Ein Vergleich der Daten des Blattsegment-Assays und der ermittelten Befallsstärke im Gewächshausversuch zeigte eine signifikante Korrelation (p=0,0002, rs=0,592). Darüber hinaus korrelierten die Werte des Assays mit den Felddaten aus dem Jahr 2009 (p=0,0005, rs=0,576) und 2010 (p=0,002, rs=0,513). Eine signifikante Korrelation wurde auch zwischen den Daten der Feldversuche der beiden untersuchten Jahren gezeigt (p=0,04, rs= 0,419). Mittels qPCR wurde Rcc in allen getesteten Genotypen nachgewiesen, d.h., dass keiner der Genotypen komplett resistent war. Die Ergebnisse zeigen, dass ein Nachweis des Pathogens in frühen Wachstumsstadien bereits vor der Symptomausbildung mittels PCR möglich ist. QPCR Analysen zeigten eine starke Korrelation (p=0,00179, rs=0,851) zwischen den visuellen Boniturdaten und der pilzlichen DNA-Konzentration im F-1Blatt. Eine Anwendung der qPCR zur Selektion resistenter Gerste Genotypen ist daher möglich. Weiterhin wurde mittels HPLC eine neue Detektionsmethode für das Rcc Phototoxin Rubellin entwickelt. Mit dieser sensitiven Methode konnten Konzentrationen des Toxins bereits vor der Symptomausbildung in frühen Wachstumsstadien der Pflanze nachgewiesen werden. Die gemessenen Toxinwerte in infiziertem Blattgewebe korrelierten stark mit den Werten der Sichtbonitur (p=0,00005, rs=0,966657). Diese Methode ist daher zur Identifizierung von resistenten Gerste-Genotypen unter kontrollierten Bedingungen geeignet.de
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/
dc.subject.ddc630de
dc.titleStudies on Ramularia Leaf Spots on Barley - Resistance Phenotyping, Epidemiology and Pathogenicityde
dc.typedoctoralThesisde
dc.contributor.refereeKarlovsky, Petr Prof. Dr.
dc.date.examination2011-11-18
dc.description.abstractengThe deuteromycete, Ramularia collo-cygni (Rcc) has gained increasing importance as the causal agent of a novel leaf spot disease, Ramularia leaf spot (RLS), on barley. The disease occurs conspicuously late in the growing season. When the crop has passed the flowering stage, the disease severity in the field increases dramatically causing complete browning and leaf death within 12 days. Studies on Ramularia collo-cygni are fairly recent and classical and molecular knowledge on the disease epidemiology and control are continuously improved. Recently, molecular bioanalytical tools based on PCR have been developed and are now available for the detection of Rcc in plant tissues. This study aimed to improve knowledge on the epidemiology, pathogenicity, sources of inoculum and spread of Rcc, and to develop reliable phenotyping assays for resistance evaluation in different barley genotypes under field and greenhouse conditions. Initially, a SYBR Green-based quantitative polymerase chain reaction (qPCR) assay for quantification of fungal DNA in plant material was developed. Rcc was successfully detected and identified down to 0.1 pg in culture, in host plant tissues and in seeds as well as in rain and snow. Qualitative PCR analyses revealed the transmission of the fungus from seeds into emerging plants and confirmed the spread of the fungus in adult plants in a symptom-less manner. Under greenhouse conditions, the symptomless stage of RLS persisted throughout the first generation of plants emerging from infested seeds until maturity and grain formation. Hot water treatment of seeds did not eliminate Rcc or impair the transfer of the pathogen into the developing plant. Further studies on effects of seed dressings and consecutive applications of foliar fungicides during plant development were conducted in order to produce pathogen-free plants. The efficacy of the seed dressing fungicide Zardex G (cyproconazole and imazalil) and the systemic foliar fungicide Proline (prothioconazole) on fungal systemic spread was assessed during different growth stages by means of real time PCR. Results show that both fungicides were not effective in controlling fungal development inside the plants when used separately. However, using Zardex G before sowing the seeds and applying Proline at early growth stages (39-41) had the strongest inhibitory effect on fungal development. In a parallel study, the mobility and spread of Rcc inoculum through the air and over large distances was investigated using spore traps placed either close to a barley field or in a place at long distance from any fields. Rcc conidia were detectable during late autumn and winter months at larger distance from fields and in higher elevation above ground. This suggests that Rcc inoculum is widespread also in the cooler season and may spread over large distances via the atmosphere and in rain water or snow. In the screening assay, different spring barley genotypes were evaluated for resistance to RLS. Evaluations were conducted in replicated experiments in a growth chamber (with leaf segments) and under greenhouse and field conditions (with whole plants) at mature growth stages (73-75). Genotypes displayed significant differences in their response to Rcc infection in the field, greenhouse, and the growth chamber experiments. Upon naturally infection in the field, the cultivar IPZ 24727 was significantly more resistant to Rcc compared to the other cultivars. A significant correlation has been shown between greenhouse experiment (whole plant inoculation) and field experiment 2009 (p=0.005, rs=0.483) and field experiment 2010 (p=0.03, rs=0.384). A significant correlation was found between leaf segment assay and severity of leaf symptoms in the greenhouse experiments (p=0.0002, rs=0.592) and leaf segment assay between field experiment 2009 (p=0.0005, rs=0.576) and field experiment 2010 (p=0.002, rs=0.513). A significant correlation has been also observed between field experiments in two different years (p=0.04, rs=0.419). By using qPCR, DNA of Rcc was detected in all barley genotypes. This suggests that none of the spring barley cultivars was completely resistant to Rcc. The results indicate that the PCR was able to detect the presence of the pathogen before appearance of the symptoms at early growth stages. Quantitative real time PCR analyses demonstrated a strong correlation (p=0.00179, rs=0.851) between the visual disease symptoms and fungal DNA concentration in leaf F-1, suggesting that quantitative real-time PCR can be used for the selection of resistant barley. Furthermore, a novel detection method for the Rcc phytotoxin, rubellin, was developed by using HPLC with fluorescence detector. With this method, the presence of the toxin was detected before appearance of the symptoms at early growth stages. Levels of fungal toxins in infected leaf tissue correlated strongly (p=0.00005, rs=0.966) with the visual disease symptoms. These results demonstrate the potential for screening barley cultivars for Rcc resistance under controlled conditions.de
dc.contributor.coRefereeBecker, Heiko C. Prof. Dr.
dc.subject.engRamularia collo-cygni, resistance screening, barley, toxin analysis, quantitative PCRde
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-11858/00-1735-0000-0001-BC13-F-5
dc.affiliation.instituteFakultät für Agrarwissenschaftende
dc.subject.gokfullLand- und Forstwirtschaft (PPN621302791)de
dc.identifier.ppn770741150


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