Methodical improvements in microspore culture of Brassica napus L.
Methodische Verbesserungen in der Mikrosporenkultur von Brassica napus L.
by Sarah Klutschewski
Date of Examination:2013-02-14
Date of issue:2013-11-05
Advisor:Dr. Christian Möllers
Referee:Dr. Christian Möllers
Referee:Prof. Dr. Traud Winkelmann
Referee:Prof. Dr. Petr Karlovsky
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Format:PDF
Abstract
English
The utilisation of microspore in vitro culture and chromosome doubling for production of homozygous and doubled haploid plants is an important issue in modern breeding programs. Nevertheless, insufficient Colchicine induced diploidisation and direct embryo to plant conversion of microspore derived embryos still represent major drawbacks for an efficient application of the doubled haploid technology. Usually, most of the embryos undergo secondary embryogenesis which requires laborious, time- and cost-intensive multiple sub-culturing of the shoots. For that reason the following work, consisting of two studies, was conducted to further improve the doubled haploid technology in oilseed rape (Brassica napus L.). The aim of the first study was to enhance the Colchicine induced diploidisation frequency and to test the less toxic antimitotic herbicides Amiprophos-methyl (APM) and Pronamide with a higher affinity to plant tubulin without the reduction of direct embryo to plant conversion frequencies. The combination of antimitotic agents APM, Pronamide and Colchicine led to no efficient diploidisation frequency and consequently, no synergistic effect was detected. The 8 tested genotypes resulted in 40% to 64% diploid plantlets (means from all treatments). The diploidisation frequency of the treatments varied from 33% (3 µM APM) to 70% (25 µM Colchicine). A significant effect on the direct embryo to plant conversion rate was not detected and ranged from 14% to 23%. Different Colchicine concentrations (250, 150, 125, 25 µM) of four tested genotypes showed Colchicine induced diploidisation frequencies varying from 58% to 66%. The highest mean of 77% doubled haploid plantlets was achieved by the treatment with 250 µM Colchicine incubated for 48 hours. In practice antimitotic agents are usually dissolved in dimethyl sulphoxide (DMSO) with a final concentration from 0.03% to 3%. No significant effect of a low and a relatively high DMSO concentration in combination with a standard Colchicine (250 µM, 36 h) treatment was detected on diploidisation and direct embryo to plant conversion rate of four winter oilseed rape genotypes. In addition, the spontaneous and Colchicine induced diploidisation frequencies of 17 winter oilseed rape genotypes including cultivars and their F1-crosses were examined and the ability of their microspore derived embryos to convert directly to plantlets was evaluated. The spontaneous induced diploidisation frequency showed a wide range from 15% to 69% and the colchicine induced diploidisation frequency ranged from 40% to 83%. For all tested genotypes, the direct embryo to plant conversion rate widely varied from 2% to 35%. Regarding all experiments of the first study, the observed spontaneous and antimitotic induced diploidisation and the direct embryo to plant conversion frequency were genotype dependent. The aim of the second study was the improvement of the direct embryo to plant conversion frequency of microspore derived embryos and the reduction of secondary embryogenesis. In the first experiment the effect of ten shoot regeneration media supplemented with and without phytohormones (gibberellic acid, indole-3-butyric acid and 6-benzylaminopurine) and a 14-day cold treatment at 4 °C (Light Thermostat) of microspore derived embryos on direct embryo to plant conversion frequency was tested. The cold treatment with 4 °C was linked with eight hours and continuous light. For standard cultivation microspore derived embryos were exposed to 26 °C and 12 hours light. The five tested winter oilseed rape cultivars showed a range from 13% to 39% directly converted plantlets. The cultivation of microspore derived embryos on Gamborg B5 media supplemented with 0.1 mg/L gibberellic acid achieved the highest mean of 43%, while cultivation on B5 media supplemented with 0.1 mg/L indole-3-butyric acid and 0.2 mg/L 6-benzylaminopurine resulted in a mean of 11%, only. The two-week cold treatment significantly increased the frequency of direct embryo to plant conversion from 14% (under standard conditions) to 28%. In a following experiment, the effect of the four, previously most efficient, media and a 14-day cold treatment at 1.5 °C and at 4 °C (Light Thermostat) were tested on direct embryo to plant conversion frequency. The cold treatment at 1.5 °C was linked with eight hours of light and also with continuous darkness, while the cold treatment at 4 °C was linked with continuous light and continuous darkness. This experiment was conducted with 13 winter oilseed rape genotypes including cultivars and F1-hybrids and showed a wide range from 29% to 76% of direct embryo to plant conversion rate. In comparison to cultivation under standard conditions, the cold treatment at 1.5 °C and at 4 °C with and without light significantly increased the number of directly regenerated plantlets from 21% to 71%. For the tested culture media, the variation of direct embryo to plant conversion frequencies ranged from 50% (Murashige and Skoog) to 60% (Gamborg B5 with 0.1 mg/L gibberellic acid). Results of the study showed that although the ability of microspore derived embryos to convert directly to plantlets is mainly genotype dependent, a 14-days cold induction at 1.5 °C and at 4 °C significantly increased the direct embryo to plant conversion frequency. In conclusion, an efficient direct embryo to plant conversion of about 70% could be achieved for most of the tested genotypes by cold treatment at 1.5 °C without light. Therefore time- consuming in vitro-subcultivation could be considerably reduced resulting in an accelerated production of doubled haploid lines for application in practical oilseed rape breeding.
Keywords: microspore culture; Brassica napus L.; secondary embryogenesis; doubled-haploid lines; microspore embryos; colchicine; APM; pronamid
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Bei der routinemäßigen Anwendung der Mikrosporenkultur zur Herstellung doppelt-haploider Linien kommt es bis heute zu Engpässen in der praktischen Rapszüchtung. Die Hauptprobleme stellen eine unzureichende Colchizin-induzierte Diploidisierungsrate und eine niedrige direkte Regeneration von Pflanzen aus Mikrosporen-Embryonen dar. Ein hoher Prozentsatz an Rapsembryonen aus Mikrosporenkultur durchläuft den Prozess der sekundären Embryogenese, der eine zeitintensive Subkultivierung erfordert. Hierbei werden die direkten Sprossansätze wiederholt von undifferenziertem Gewebe freigeschnitten bis eine Überführung in Erde und die letztendliche Regeneration zu doppelt-haploiden Pflanzen möglich ist. Die vorliegende Doktorarbeit besteht aus zwei Studien, die sich mit dem Thema: „Methodische Verbesserungen der Mikrosporenkultur in Brassica napus L.“ auseinandersetzen.
Ziel der ersten Studie war die Erhöhung der Colchizin-induzierten Diploidisierungsrate von Mikrosporen ohne die Regeneration von Pflanzen aus den Mikrosporen-Embryonen zu verringern und damit die Entwicklung zu doppelt-haploiden Pflanzen zu verzögern. Aufgrund der hohen Toxizität von Colchizin wurden die weniger toxischen Mitosehemmstoffe Amiprophos-methyl (APM) und Pronamid, die eine höhere Affinität zu Pflanzentubulin als Colchizin besitzen, allein und in Kombination mit Colchizin untersucht. Eine Kombination dieser Mitosehemmstoffe führte zu keiner effizienten Diploidisierungsrate; demnach konnte ein synergistischer Effekt ausgeschlossen werden. Die acht untersuchten Winterrapsgenotypen erzielten eine Diploidisierungsrate von 40% bis 64%. Die Mitosehemmstoff-Behandlungen der isolierten Mikrosporen variierten hierbei zwischen 33% (3 µM APM, 72 Stunden) und 70% (25 µM Colchizin, 72 Stunden). Ein signifikanter Einfluss der Mitosehemmstoffe auf die Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen konnte nicht nachgewiesen werden. In Abhängigkeit der Genotypen konvertierten 14% bis 23% direkt. Unterschiedliche getestete Colchizinkonzentrationen (250, 150, 125, 25 µM) zeigten für 4 untersuchte Genotypen eine Colchizin-induzierte Diploidisierungsrate von 58% bis 66%, wobei die Behandlung 250 µM Colchizin für 48h die höchste Rate aufwies. Ein signifikanter Einfluss von Dimethylsulfoxid (DMSO), das oftmals als Lösungsmittel der angewendeten Mitosehemmstoffe verwendet wird, konnte jedoch nicht in den untersuchten Konzentrationen (0,3% und 3%) in Kombination mit der Colchizin-Behandlung (250 µM, 72 Stunden) auf die Diploidisierungsrate und die direkte Konversionsrate nachgewiesen werden. Weiterhin wurden 17 Winterrapsgenotypen bezüglich ihrer spontanen und ihrer Colchizin-induzierten Diploidisierungsrate untersucht und deren Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen zu Regeneraten mit direkten Sprossansätzen bestimmt. Die ausgewählten Genotypen enthielten sowohl Sorten als auch F1–Hybriden. Die spontan-induzierte Diploidisierungsrate zeigte eine große Variation von 15% bis 69%. Im Vergleich dazu erreichte die Colchizin-induzierte Diploidisierungsrate Werte von 40% bis 83%. Die Mikrosporen-Embryonen der getesteten Genotypen wiesen ebenfalls eine große Spannbreite bezüglich ihrer direkten Konversionsrate auf. Die Ergebnisse zeigten keinen signifikanten Einfluss der Mitosehemmstoff-Behandlung auf den Regenerationserfolg der Mikrosporen-Embryonen zu Pflanzen. Sowohl die beobachtete spontane und die Mitosehemmstoff-induzierte Diploidisierung als auch die Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen zu Regeneraten mit direkten Sprossansätzen waren stark Genotyp-abhängig.
Ziel der zweiten Studie war die Erhöhung der direkten Regeneration der Mikrosporen-Embryonen zu Pflanzen trotz der starken Abhängigkeit der Genotypen. Zunächst wurde der Einfluss von zehn unterschiedlichen Sprossregenerationsmedien mit und ohne Phytohormone (Gibberellinsäure, 6-Benzylaminopurin, 3-Indolylbuttersäure) und eine 14-tägige Kältebehandlung bei 4 °C (Lichtthermostat) auf die direkte Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen von 5 Winterrapsgenotypen untersucht. Die 14-tägige Kältebehandlung erfolgte sowohl unter acht Stunden Licht als auch in Dunkelheit. Die Standardkultivierung der Mikrosporen-Embryonen erfolgte im Kulturraum bei 26 °C und 12 Stunden Licht. 13% bis 39% der Mikrosporen-Embryonen konvertierten direkt, wobei die höchste Rate von 43% nach Kultivierung der Embryonen auf Gamborg B5-Medium mit 0.1 mg/L Gibberellinsäure resultierte. Die Mittelwerte der Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen zu Regeneraten mit direkten Sprossansätzen aller untersuchten Genotypen und Kulturmedien wurden durch die 14-tägige Kältebehandlung (28%) gegenüber der Standardkultivierung (14%) signifikant erhöht. Nachfolgend wurde der Einfluss der vier effizientesten Sprossregenerationsmedien und eine 14-tägige Kältebehandlung bei 1.5 °C und bei 4 °C (Lichtthermostat) auf die Konversionsrate von Mikrosporen-Embryonen von 13 Winterrapsgenotypen untersucht. Die Kältebehandlung bei 1.5 °C erfolgte unter Lichtabwesenheit als auch unter acht Stunden Licht. Die Kältebehandlung bei 4 °C erfolgte dagegen in Dauerlicht und Dauerdunkel. Zwischen 29% und 76% der Mikrosporen-Embryonen konvertierten direkt. Im Vergleich zur Kultivierung unter Standardbedingungen konnte mit der Kältebehandlung eine signifikante Erhöhung erzielt werden (von 21% auf bis zu 71%). Nach vorheriger Kultivierung der Mikrosporen-Embryonen auf den unterschiedlichen Kulturmedien variierte die Konversionsrate zwischen 50% (MS) und 60% (B5 mit 0.1 mg/L Gibberellinsäure). Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigten, dass trotz einer vorherrschenden starken Abhängigkeit vom Genotyp, die direkte Konversionsrate der Mikrosporen-Embryonen mit Kältebehandlung (1.5 °C im Dauerdunkel) signifikant erhöht werden konnte. Fast alle Genotypen zeigten Konversionsraten der Mikrosporen-Embryonen von über 70%. Es ist demnach möglich die sekundäre Embryogenese und die damit verbundene zeitintensive in vitro-Subkultivierung erheblich zu reduzieren, und dadurch den Entwicklungsprozess von doppelt-haploiden Linien zur Verwendung in der praktischen Rapszüchtung zu beschleunigen.