Untersuchungen zur Funktion des tripartite-motif-22 (TRIM22)-Proteins
Functional analysis of the tripartite-motif-22 (TRIM22) protein
by Cornelius Deuschl
Date of Examination:2013-10-21
Date of issue:2013-11-11
Advisor:Dr. Jens Gruber
Referee:Prof. Dr. Lutz Walter
Referee:Prof. Dr. Markus Bohnsack
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-4102
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Name:Finale Dissertation ediss 13.10.13.pdf
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Abstract
English
TRIM22 is an intracellular protein that has previously been shown to exhibit manifold functions in human cells. TRIM22 is described to have antiviral potential, may function as an ubiquitin E3 ligase and is described to be involved in cellular processes like cell differentiation and cell proliferation. In this study, the intracellular distribution of TRIM22 and a potential role of TRIM22 in microRNA processing was analyzed. Immunofluorescence microscopy was used for evaluation of subcellular distribution and co-immunoprecipitation to examine protein interactions. Luciferase assays were used for functional analysis. Subcellular expression of TRIM22 was analyzed with endogenously and ectopically expressed TRIM22 protein. TRIM22 was co-localized with the nucleus, the perinuclear region and the cytoskeleton. Moreover, a co-localisation of endogenously expressed TRIM22 with the centrosome was confirmed, but was surprisingly not found for ectopically expressed TRIM22. Further, the influence of TRIM22 expression on cell vitality was analyzed. Knockdown of TRIM22 expression by RNA interference increased the incidence of mitotic aberrant and apoptotic cells. Increased expression by ectopically expressed TRIM22 augmented the number of polyploid cells and disturbed cell vitality was found. In the second part of this study the interaction of TRIM22 and components of the silencing machinery was studied by immunofluorescence microscopy and co-immunoprecipitation. The experiments revealed a previously unknown direct or indirect interaction of TRIM22 with components of the RNA silencing machinery. A reduction of endogenous microRNA expression was observed by performing a luciferase assay and knockdown of TRIM22 expression. The distribution studies of the TRIM22 protein confirmed previously published works. Differences in the binding pattern between endogenously and ectopically expressed TRIM22 in relation to the centrosome were described for the first time and could be explained by protein interactions. This study expands the functional repertoire of TRIM22 in the context of RNA-dependent RNA silencing. In particular, TRIM22 appears to be involved in processing and activity of human small RNAs with gene-regulatory activity. TRIM22 may serve as a linker protein between the cytoskeleton and components of the silencing machinery. Further studies are needed to understand this particular role.
Keywords: TRIM22, microRNA processing, RNAi
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TRIM22 ist ein intrazelluläres Protein, das ein heterogenes Aufgabenspektrum erfüllt. Bisher wurden antivirale Funktionen und Zusammenhänge mit zellulären Prozessen wie Zelldifferenzierung und Zellproliferation beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Beteiligung an der mikroRNA-Prozessierung untersucht, sowie Lokalisationsstudien des Proteins durchgeführt. Lokalisationsstudien erfolgten mittels IF-Mikroskopie, während Proteininteraktionen anhand der Co-Immunpräzipitation untersucht wurden. Die funktionellen Untersuchungen erfolgten durch Luziferaseassays.
Zu Beginn wurde die subzelluläre Expression des endogenen und ektopisch exprimierten TRIM22-Proteins untersucht. TRIM22 konnte sowohl im Nukleus, als auch in der perinukleären Umgebung und am Zytoskelett lokalisiert werden. Zudem konnte eine Co-Lokalisation des endogenen TRIM22 mit dem Zentrosom bestätigt werden, was jedoch nicht für ektopisch exprimiertes TRIM22 zutraf.
Des weiteren wurde der Einfluss der TRIM22-Über- bzw. Unterexpression auf die Zellvitalität überprüft. Nach TRIM22-Knockdown mittels RNAi zeigten sich vermehrt mitotisch aberrante und apoptotische Zellen. Bei Überexpression konnten vermehrt polyploide Zellen nachgewiesen werden. Zudem gab es hierbei Hinweise auf Zellvitalitätsstörungen.
Im letzten Teil der Arbeit gelang mittels IF-Mikroskopie und Co-Immunpräzipitation die Erstbeschreibung einer Interaktion zwischen TRIM22 und Komponenten der zellulären Silencing-Maschinerie. Diese Beobachtung konnte durch den Nachweis einer funktionellen Beteiligung des Proteins an der mikroRNA-Prozessierung erweitert werden.
Die beschriebenen Lokalisationen des TRIM22-Proteins bestätigen die Aussagen externer Publikationen. Das divergente Bindungsverhalten des endogenen und ektopisch exprimierten TRIM22 bezüglich des Zentrosoms wurde erstmalig beschrieben und ist vermutlich auf Proteininteraktionen zurückzuführen. Das funktionelle Spektrum des TRIM22-Proteins wurde im Rahmen dieser Arbeit um eine Beteiligung in der mikroRNA-Prozessierung erweitert. Eine Funktion als Trägerprotein und ein Mitwirken in der Silencing-Maschinerie wären denkbar und sollten in zukünftigen Studien überprüft werden.
Schlagwörter: TRIM22, miRNA-Prozessierung, RNAi