Isolation and molecular characterization of the stearoyl-CoA desaturase (SCD) gene affecting fat deposition in pigs

Abstract

Das Enzym Stearoyl-CoA Desaturase (SCD) katalysiert die Desaturierung langkettiger Fettsäuren. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Isolierung der porcinen SCD cDNA sowie die Klonierung und molekularbiologische Charakterisierung des porcinen SCD Gens. Die isolierte cDNA umfasst insgesamt 5134 Basenpaare (bp) und enthält einen offenen Leserahmen von 1080 bp, der für ein Protein von 395 Aminosäuren kodiert. Die untranslatierte Region am 3'-Ende der mRNA ist mit 3848 bp ungewöhnlich lang und beginnt im letzten Exon des Gens. Für das funktionelle Protein wurde eine molekulare Masse von 41,3 kDa errechnet, der isoelektrischer Punkt beträgt 9,4. Im Vergleich mit den Aminosäuresequenzen des SCD Proteins verschiedener Säugetierspezies zeigt das porcine SCD hohe Homologien (>80%).Um die genomische Struktur des porcinen SCD Gens zu ermitteln wurden insgesamt 20985 bp eines genomischen PAC-Klons sequenziert. Das porcine SCD Gen entspricht im Hinblick auf seine genomische Organisation mit sechs Exons den bisher beschriebenen orthologen Genen anderer Säugetierspezies. Die Längen der einzelnen Exons rangieren zwischen 131 bp und 16186 bp und stimmen mit den Exonlängen der SCD Gene anderer Spezies überein. Die Intronsequenzen des porcinen SCD Gens variieren in ihrer Länge zwischen 518 bp und 4784 bp.Das porcine SCD Gen wurde auf Chromosom 14 im Bereich q27 kartiert. Die chromosomale Lokalisation des Gens erfolgte durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung und PCR-basierten Analysen von 'Hybrid panels'. Mit vergleichenden Analysen des SCD Promotors verschiedener Säugetiere konnten regulatorische Domänen indentifiziert werden. So wird zum Beispiel durch die Aktivität einer 'polyunsaturated fatty acid response region' (PUFA-RE) die Expression des SCD Gens in Abhängigkeit von der Konzentration mehrfach-ungesättigter Fettsäuren reguliert. Durch reverse Transkription (RT-PCR) von RNA, die aus verschiedenen Geweben des Schweins isoliert worden war, konnte gezeigt werden, dass das porcine SCD Gen ubiquitär expremiert wird.Desweiteren wurden Mutationsanalysen für das komplette SCD Gen durchgeführt. Insgesamt wurden 26 Polymorphismen entdeckt, 24 dieser Polymorphismen stellen Einzelnukleotidsubstitutionen (engl. Single Nucleotide Polymophism, SNP) dar. Außerdem wurde ein Längenpolymorphismus im vierten Intron sowie eine Triplet-Insertion im fünften Intron des SCD Gens gefunden. Keiner der beschriebenen SNPs führt zu einem Austausch der kodierten Aminosäure.Allerdings wurden signifikante Unterschiede in den Allelfrequenzen am SNP T(-233)C und am SNP C(641)T im Vergleich von europäischen Schweinerassen (Deutsche Landrasse, Large White, Duroc) und chinesischen Schweinerassen (Erhualian, Luchuan, Huai) gefunden. Während das Allel T an Position -233 (Nummerierung des Nukleotids bezogen auf den Translationsstart A(+1)TG) in den europäischen Rassen mit hoher Frequenz auftritt, konnte für das Allel T an Position 641 eine höhere Frequenz in den chinesischen Schweinerassen ermittelt werden.Studien zur Assoziation der SNPs T(-233)C und C(641)T mit Merkmalen des Fettansatzes wurden soowohl an einer F2-Population der Kreuzung White Duroc mit Erhualian, als auch einer White Duroc Herde durchgeführt. Signifikante Assoziationen zwischen dem Merkmal durchschnittliche Rückenspeckdicke (gemessen an vier Punkten: Schulter, zwischen 6. und 7. Rippe, letzte Rippe und Hüftgelenk) und den Allelvarianten des SNP C(641)T konnten innerhalb der F2-Kreuzungspopulation ermittelt werden (P<0.05). Die Allelvariante daher negativen Effekt und führt zu einer erhöhten Rückenspeckdicke.