Molecular and functional characterization of potential pathogenicity related genes from <i>Verticillium longisporum</i>

Abstract

Die Gattung Verticillium gehört zu einer der am weitest verbreiteten Gruppen von pflanzenpathogenen Pilzen auf der Welt und beheimatet eine Vielzahl von Arten, die durch die Infektion der Wirtspflanzen schwere wirtschaftliche Verluste verursachen. Molekulare Studien der an der Infektion von Brassica napus mit Verticillium longisporum beteiligten Gene bieten die Möglichkeit auf ein besseres Verständnis der durch den Pilz hervorgerufenen Krankheitssymptome. Ergebnisse dieser Studien können Hilfestellung bei der Entwicklung neuer Strategien zur Vorbeugung oder der Kontrolle der Infektion geben. Die hier vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Ergebnisse der Analyse von zwei vermeintlich pathogenitätsrelevanten Genen, die im Genom von V. longisporum detektiert wurden. Zahlreiche Kandidatengene von V. longisporum wurden während der Forschung für diese Dissertation effizient durch RNA-Interferenz (RNAi) herunterreguliert. Durch die intrazelluläre Expression von den zu den Kandidatengenen gehörenden, spezifischen Hairpin (HP)-Konstrukten, wird RNAi ausgelöst. Dazu testeten wir verschiedene, in den letzten Jahren publizierte, auf PCR basierende Ansätze, um HP-Fragmente zu generieren. Alle diese Methoden nutzen die Overlap Extension-PCR (OE-PCR), um Sense- und Antisense-Fragmente eines Kandidatengens mit einem dazwischenliegenden Spacer zu verbinden und sind daher nicht abhängig von zeitraubenden Restriktionsenzym-basierenden Klonierungsschritten. Die bei der Etablierung dieser Methoden aufgetretenen Probleme geben tiefe Einblicke in die Anwendbarkeit der OE-PCR für die Konstruktion von HP-Fragmenten. Alle generierten Silencing-Mutanten wiesen eine Reduktion der spezifischen Genexpression von mindestens 90% auf, so dass wir ein zuverlässiges Werkzeug für die Charakterisierung von vermeintlich pathogenitätsrelevanten Genen erhielten, um deren Rolle im Lebenszyklus von V. longisporum zu bewerten. Während unserer Forschung konnten wir zeigen, dass die Herunterregulation eines Gens aus der Familie der Nekrose- und Ethylen-induzierenden Peptide (NEP) eine Reduktion der Symptome an B. napus hervorruft. Es konnte gezeigt werden, dass die abgeschwächten Symptome an der Wirtspflanze durch eine verminderte Fähigkeit der Silencing-Mutanten, sich in der Pflanze zu verbreiten, ausgelöst werden. Insgesamt wurden fünf NEP Gene im Genom von V. longisporum detektiert. Von diesen, als Vl-NEP-1 bis 5 bezeichneten Genen, wiesen drei Gene (Vl-NEP-1, -2, -5 ) eine starke, durch qRT-PCR gemessene in planta-Expression auf. Unsere Ergebnisse für Vl-NEP-1 zeigen, dass das synthetisierte Genprodukt in das Xylem der Wirtspflanze sekretiert wird und dabei höchstwahrscheinlich die umliegenden Zellmembranen des Xylemzylinders permeabilisiert. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Vl-NEP-1 ein Virulenzfaktor von V. longisporum während der Infektion von B. napus ist. Das zweite in der vorliegenden Arbeit behandelte Kandidatengen zeigt hohe Homologie zu Genen der Typ I Polyketid-Synthasen (PKS) des wA-Types und wurde daher als Vl-PKS-1 bezeichnet. PKS katalysieren die Aneinanderlagerung von kurzen Carbonsäureketten zu Polyketiden (PK), welche zu einer großen Gruppe von pilzlichen Sekundärmetaboliten gehören. PK von phytopathogenen Pilzen sind in der Literatur dadurch beschrieben, dass sie eine essentielle Rolle während der Interaktion mit anderen Pilzen oder als Pathogenitäts- bzw. Virulenzfaktoren in der Interaktion mit Wirtspflanzen spielen. Silencing-Mutanten von Vl-PKS-1 zeigen im Vergleich zum Wildtyp von V. longisporum eine signifikant erhöhte Wachstumsrate, einen teilweisen Verlust der Wettbewerbsfähigkeit zu anderen phytopathogenen Pilzen sowie eine verzögerte Pigmentierung des Pilzmyzels. Trotz der durch qRT-PCR gemessenen erhöhten in planta-Genexpression, konnten wir nach der Infektion von B. napus mit den Silencing-Mutanten keinen veränderten Phänotyp der Pflanzen beobachten. Daher ist es wahrscheinlich, dass Vl-PKS-1 kein Virulenz- bzw. Pathogenitätsfaktor von V. longisporum für die Infektion von B. napus ist.