Marker Assisted Selection for the development of intervarietal substitution lines in rapeseed <i>(Brassica napus L.)</i> and the estimation of QTL effects for glucosinolate content

Abstract

Raps (Brassica napus L.) ist eine der wichtigsten Ölpflanzen der Welt. In 2002 lag der Anteil von Raps an der weltweiten Anbaufläche für Ölpflanzen bei 10,13%, und die Produktion betrug 36.371.000 t. Ein besseres Wissen über die Genetik und Vererbung von Merkmalen bei Raps ist deshalb von großer Bedeutung. Nachdem das Öl extrahiert ist, dient das verbleibende Schrot als hochwertige Proteinquelle für die Tierernährung. Da aber einige Komponenten im Mehl schädliche Wirkung haben, wie die Glucosinolate, bleibt es immer noch ein Ziel der Züchtung Sorten zu entwickeln die einen geringeren Anteil an Glucosinolaten haben.Sechs QTL für Glucosinolatgehalt wurden bisher identifiziert in einer Kreuzung zwischen Mansholt' und Samourai'. Drei davon zeigen größere Effekte (major QTL) und drei nur kleine Effekte (minor QTL). In modernen Züchtungsprogrammen kommt es immer wieder vor, dass aus Kreuzungen zwischen Eltern die beide einen niedrigen Glucosinolatgehalt haben, Nachkommen entstehen, die einen höheren Gehalt als die Eltern haben. Deshalb ist ein besseres Verstehen der Vererbung dieses Merkmals erwünscht.In diesem Sinne wurde im Rahmen dieser Studie versucht, mehr über dieses Merkmal zu erfahren, in dem man zwei Ziele verfolgte. Das erste Ziel war die Erstellung eines Basismaterials für die Herstellung von Substitutionslinien ( Invervarietal Substitution Lines"). Das zweite Ziel war die Schätzung der Effekte der sechs genannten QTL durch Feldversuche mit spaltenden BC3 Familien.Für das erste Ziel sollten über markergestützte Rückkreuzungen mit Hilfe von AFLP-Markern eine Serie sog. intervarietal substitution lines" hergestellt werden. Diese Substitutionslinien enthalten vor dem gemeinsamen Hintergrund des rekurrenten Elters jeweils ein einzelnes genau definiertes Segment des Donorgenoms. In einer Serie decken diese Segmente, z. T. überlappend, das gesamte Genom des Donorelters ab. Serien solcher Substitutionslinien repräsentieren daher ein genetisch sehr gut charakterisiertes Material, das ideal geeignet ist für eine genomweite Charakterisierung alleler Variation sowohl auf phänotypischer als auch auf molekularer Ebene. Die Arbeit begann mit einer Population von doppelt haploid Linien (DH Linien) hergestellt aus einer Kreuzung zwischen zwei Winterrapssorten, ´Mansholt's Hamburger Raps´ und ´Samourai´. Zehn dieser DH Linien mit Donorsegmente die das gesamte Genom abdecken, wurden durch markergestützte Selektion ausgewählt. Diese zehn Linien wurden mit Samourai rückgekreuzt um zehn BC1 Genotypen zu erzeugen, die dann ein zweites Mal mit Samourai rückgekreuzt wurden, so dass eine BC2 Population mit 300 Pflanzen entstand. Diese wurde dann mit 140 AFLP Markern (114 loci) untersucht und 20 Pflanzen konnten selektiert werden deren Donorsegmente wiederum das gesamte Donorgenom abdeckten. Da eine bessere Abdeckung des Genoms erwünscht war, wurden in den 20 selektierten Pflanzen noch einige AFLP Primerkombinationen eingesetzt, sowie zwei Mikrosatelliten-Markern und ein RAPD-Marker, wodurch sich eine Gesamtzahl von 164 Markers (130 loci) ergab, die etwa 1325 cM des Rapsgenoms abdecken.Die 20 selektierten BC2 Genotypen wurden abermals mit Samourai rückgekreuzt um eine Population von 300 BC3 Pflanzen zu erzeugen. Diese wurde dann mit 132 Markern (120 loci) analysiert. Insgesamt 52 BC3 Pflanzen wurden selektiert deren Donorsegmente des Mansholt Genom wiederum abdecken. Allerdings wurde unter den 300 BC3 Genotypen keiner gefunden der nur noch ein Donorsegment enthält, sondern die verschiedene BC3 Pflanzen enthielten zwischen 2 und 13 Donorsegmente. Das Ergebnis war nach vorliegenden Studien unerwartet. In diesen Studien waren in der BC3 schon Genotypen aufgetreten, die nur ein Donorsegment enthielten. Aber eine genauere Betrachtung dieser Untersuchungen zeigte dass bei der Selektion nicht das gesamte kartierte Genom berücksichtig worden war, also mit den hergestellten Substitution Linien wurde nicht das gesamte kartierte Donorgenom abgedeckt. In der vorliegenden Studie wurde dagegen immer das ganze kartierte Genom betrachtet sofern die Markerabdeckung es ermöglichte.Was es dem zweiten Ziel angeht, die Rückkreuzungspopulationen die herstellt wurden für die Entwicklung des Substitutionslinien, wurden auch für die Schätzung der Effekte der sechs QTL für Glucosinolatgehalt benutzt. Die Nachkommenschaften der mit Markern analysierten BC2 Pflanzen wurden in zwei Feldversuchen in Göttingen getestet. 279 BC3 Familien, die 10 selektierten DH Linien und die entsprechenden BC1 Genotypen sowie die Eltern der Kreuzung wurden im Jahr 2001/2002 in Parzellen mit je 50 Pflanzen angebaut. Der Glucosinolatgehalt in den Körnern wurde in ganzen Korn durch NIRS (near infrared reflectance spectroscopy) gemessen. Von den angebauten Familien wurden, nach Abschluss der Markerselektion, nur die Familien ausgewählt, die für einen oder zwei QTL segregierten. Von diesen Familien wurden dann einzeln Pflanzen geerntet und mit NIRS gemessen um innerhalb der Familien die Spaltung erkennen zu können. Der QTL Effekt bei den BC3 Familien, die für nur einen QTL segregierten, wurde aus der Differenz zwischen den phänotypischen Klassen, die sich durch die Segregation ergaben, bestimmt.Für die zwei major QTL auf den Kopplungsgruppen 16 und 18 wurde eine klare 1:1 Spaltung erkennbar, was allerdings nicht bei der Kopplungsgruppe 9, oder bei den minor QTL der Fall war. In Familien wo die phänotypischen Klassen nicht klar zu erkennen waren wurde der QTL Effekt geschätzt mittels eines Vergleichs zwischen dem phänotypischen Mittelwert (z) der BC3 Familie und dem phänotypischen Mittelwert (y) des rekurrenter Elters (Samourai) unter der Annahme das "z" durch folgende Formel errechnet werden kann: "z = (x + y)/2". Hier steht "x" für den der phänotypischen Wert der heterozygoten Klasse und "y" für den homozygoten Klasse, die Samourai entspricht. Der phänotypische Wert der heterozygoten Klasse der spaltenden BC3 Familien (die für nur einen QTL spalten) kann dann nach Umformung als "x = (2z) - y" errechnet werden, und der QTL Effekt als die Differenz zu Samourai, also als "x-y".Die Effekte der 2 major QTL (auf Kopplungsgruppen 16 und 18), aber auch der dritte QTL (Kopplungsgruppen 9), sind so deutlich, dass dessen genaue Lokalisierung (aus früheren Studien durch composite interval mapping') bestätigt werden konnte. In den BC3 Familien ist der QTL Effekt die Summe von Additiv- und Dominanzeffekt, wobei epistatische Effekte nicht ausgeschlossen sind. Wenn man diese QTL Effekte mit den durch Intervall Kartierung geschätzten Werten vergleicht, erkennt man dass deutliche Dominanzeffekte vorhanden sind. Für den QTL auf Kopplungsgruppe 18 sind Additiv- und Dominanzeffekte etwa gleich groß. Bei den anderen zwei QTL sind die Dominanzeffekte größer als die Additiveffekte. Für die 3 minor QTL konnten Effekte gefunden werden aber nur der Effekt auf Kopplungsgruppe 3 war statistisch signifikant. Epistatische Effekte konnten ebenfalls nachgewiesen werden, und zwar in den BC3 Familien die für 2 QTL spalten.