Das vollständige HIV-1 Tat Protein überquert Lipidmembranen? Einfluss des positiven Ladungsclusters und des N-terminalen Bereichs

Abstract

Die durch das HI-Virus ausgelöste Krankheit AIDS stellt eine große Herausforderung für die Forschung dar. Seit Entdeckung des Virus im Jahr 1983 gibt es weder eine absolute Heilung der Krankheit noch konnte bisher ein Impfstoff entwickelt werden. Das HIV-Protein Tat spielt bei der Verbreitung des Virus eine entscheidende Rolle. Als Transaktivator der Transkription erhöht es die Transkriptionsrate um den Faktor 100, was zu einer schnelleren und effizienteren Infizierung neuer Zellen durch das HI-Virus führt. Je früher Tat in einer noch nicht infizierten Zelle zugegen ist, desto schneller kann das Virus seinen Replikationszyklus durchlaufen und sich verbreiten. Das von der basischen Region des Proteins abgeleitete Tat-Peptid (48-57) ist in der Literatur bekannt. Es gehört zu den cell penetrating peptides und ist in der Lage, Poren in Membranen auszubilden und diese zu durchqueren. Es war das Ziel der vorliegenden Arbeit, zu untersuchen, ob der vollständige Wildtyp des Tat-Proteins (1-86) in der Lage ist, Membranen zu überqueren. Mithilfe fluoreszenz- und rasterkraftmikroskopischer Untersuchungen an festkörperunterstützten Membranen sollte ermittelt werden, ob das Tat-Protein an Membranen bindet und wie es die Struktur der Membran beeinflusst. Mittels Experimenten an Lipidvesikeln verschiedener Größe sollte herausgefunden werden, ob das Tat-Protein Poren in Membranen ausbildet und ob es Membranen überqueren kann. Um zu untersuchen, welche Strukturelemente des Tat-Proteins für die Wechselwirkungen mit Membranen verantwortlich sind, wurden drei Varianten des Proteins verwendet. Neben dem vollständigen Wildtyp mit 86 Aminosäuren (wt Tat (1-86)), kam ein verkürzter Wildtyp, dem 34 Aminosäuren im N-terminalen Bereich fehlen, zum Einsatz (wt Tat (35-86)). Des Weiteren wurde mit einer Tat-Mutante (Tat ARM-Ala) gearbeitet, die einen um drei Ladungen verringerten Ladungscluster besitzt. Weiterhin sollte durch Variation der Lipidzusammensetzung der Membranen der Einfluss von Ladung und Struktur der Lipide innerhalb der Membran auf die Protein-Membran-Wechselwirkung untersucht werden. Fluoreszenz- und rasterkraftmikroskopische Analysen an festkörperunterstützten Membranen zeigen, dass Tat nicht an die Membran bindet. Es wurde hingegen eine Destabilisierung der Membran durch Tat beobachtet, die sich in Bildung von Defekten äußerte. Experimente an Lipidvesikeln beweisen, dass der vollständige Wildtyp des Tat-Proteins (1-86), im Gegensatz zum Tat-Peptid (48-57), keine Poren in Lipidmembranen ausbildet, durch die Fluoreszenzfarbstoffe die Membran passieren können. Allerdings konnte mithilfe von fluoreszenzmarkiertem Tat-Protein (Tat-AF633) gezeigt werden, dass dieses selbst in der Lage ist, die Membran zu überqueren. Weiterhin wurde beobachtet, dass es im Zuge der Translokation zu einer Akkumulation des fluoreszenzmarkierten Proteins in den Membranen kam. Tat-AF633 induzierte im Gegensatz zum unmarkierten Tat-Wildtyp Poren in Lipidmembranen von GUVs (giant unilamellar vesicles), durch die Farbstoffe mit einer molaren Masse von 3 kDa die Membran passieren konnten. Größere Farbstoffe mit einer molaren Masse von 10 kDa blieben ausgeschlossen. Tat-AF633 mit einer molaren Masse von 11,6 kDa war hingegen in der Lage, die Membran zu überqueren, was beweist, dass es die Membran nicht durch die gebildeten Poren passiert hat. Tat-AF633 zeigte die Fähigkeit, sowohl zwitterionische, als auch negativ geladene Membranen in Gegenwart von Ionen zu überqueren. In Abwesenheit von Ionen fand die Translokation nur bei Membranen statt, die das Lipid DOPE enthielten. Um zu untersuchen, welche Strukturelemente des Tat-Proteins für die Interaktion mit Lipid-membranen verantwortlich sind, wurde neben dem vollständigen Wildtyp auch ein verkürzter Wildtyp sowie eine Tat-Mutante mit reduziertem Ladungscluster eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass diese beiden Protein-Varianten Poren in Lipidmembranen verschiedener Zusammensetzungen Poren induzieren konnten, so dass Fluoreszenzfarbstoffe über die Membran in die GUVs eindringen konnten. Abschließend kann angenommen werden, dass in Gegenwart von Anionen, die die positiven Ladungen des Proteins gegeneinander abschirmen, Tat Oligomere bildet, die aufgrund einer höheren Hydrophobizität die Membran passieren können. Weiterhin begünstigt DOPE die Translokation, da in diesen Membranen Wassermoleküle eingelagert sind, was die Insertion des Proteins in die Membran erleichtert, so dass Tat auch in nicht oligomerisierter Form diese Membranen passieren kann. Diese Eigenschaft des Proteins spielt bei der Verbreitung des HI-Virus eine wichtige Rolle, da das Protein somit in der Lage ist, in noch nicht infizierte Zellen einzudringen. So kann die Transkriptionsrate von Beginn an drastisch gesteigert werden, was zu einer schnelleren Infizierung führt. Diese Eigenschaft macht Tat zu einem wichtigen Angriffspunkt bei der Bekämpfung von HIV.