Isolation, molecular characterisation and chromosomal location of repetitive DNA sequences in Brassica

Abstract

Pflanzengenome enthalten einen großen Anteil repetitiver DNA. Verwandte Arten haben viele identische repetitive Sequenzen, aber einige von ihnen sind auch art- oder genomspezifisch. Diese genomspezifischen repetitiven Sequenzen können z.B. als Chromosomen-Marker zur Unterscheidung von Genomen in etablierten oder neu hergestellten Arthybriden in sehr frühen Entwicklungsstadien verwendet werden.Raps, B. napus (2n=38, AACC), ist ein natürlicher Hybrid der sehr eng verwandten Arten Rübsen, B. rapa (2n=20, AA), und Kohl, B. oleracea (2n=18, CC). Um eine bessere Charakterisierung der Rapschromosomen zu erreichen, wurden artspezifische repetitive DNA Sequenzen von B. oleracea gesucht, welche das A und C Genome im Raps unterscheiden können. Diese Sequenzen sollen bei der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) als genom- oder chromosomenspezifische Marker dienen.Phagen- und Plasmid-Bibliotheken wurden jeweils durch Plaque- und Dot-Blot- Hybridisierung untersucht, wobei die Gesamt DNAs des A- und des C- Genoms als Sonde verwendet wurden. In den Phagen-Bibliotheken wurden mehr als 100.000 Plaques getestet. Nach der Hybridisierung von Replicafiltern mit B. oleracea oder B. rapa Gesamt-DNA zeigten nur 0,45%-2,40% aller Klone der Bibliotheken starke Hybridisierungssignale und konnten als repetitive Sequenzen erkannt werden. Da nur ein sehr geringer Anteil der Klone in den Bibliotheken repetitive Sequenzen aufwies, sind Phagen-Bibliotheken offensichtlich schlecht für die Suche nach repetitiven artspezifischen Sequenzen geeignet, wenn Gesamt DNA als Sonde verwendet wird.In den Plasmid-Bibliotheken wurden 1164 Klone mit Hilfe der Dot-Blot-Hybridisierung getestet. Nach der Hybridisierung von Replicafiltern zeigten ca. 21% der Klone starke Hybridisierungsignale mit B. oleracea Gesamt-DNA, und wurden als repetitiven Ursprungs identifiziert. Die Hybridisierungsmuster der Dot-Blot-Filter mit beiden Sonden wurde verglichen und 15 Klone, welche stärkere Hybridisierungsintensitäten mit dem C-Genom zeigten, wurden weiter über eine Southern-Blot Hybridisierung analysiert, um die Dot-Blot Ergebnisse zu prüfen. Drei Klone (pBo1.6, pBo1.27 und pBo2.157) konnten in dieser Untersuchung als häufiger im C-Genom vorkommend bestätigt werden ( C-Genom-angereicherte Klone ). Diese Klone, sowie zwei hoch-repetitive Klone (pBo2.94 und pBo1.173), welche in der Dot-Blot-Hybridisierung gleichstarke Signale für das A- und C- Genom gezeigt haben, wurden sequenziert, mit DNA-Datenbanken verglichen und mit Hilfe der FISH in den Chromosomen von B. oleracea, B. rapa und B. napus lokalisiert. Die hoch-repetitiven Klone wurden darüber hinaus auch in B. carinata (Abessinischer Senf) untersucht. Weiterhin wurde durch FISH, mit Hilfe ribosomaler DNA (rDNA) Sonden, die ribosomalen RNA Loci in den Chromosomen der A und C Genome von Brassica lokalisiert.In Übereinstimmung mit der Literatur wurden in B. oleracea, B. rapa und B. napus jeweils drei, sechs und neun Chromosomenpaare mit 5S und/oder 45S rDNA Loci gefunden. Die hoch-repetitiven Klone, pBo2.94 (238 Bp) und pBo1.173 (158 Bp), waren homolog zu schon beschriebenen Zentromer-Sequenzen von Brassica (bis zu 97% Sequenzidentität) und wurden durch FISH in den Zentromeren von 12, 12-14, 16 beziehungsweise 28-30 Chromosomen in B. carinata, B. oleracea, B. rapa und B. napus lokalisiert.Von den C-Genom-angereicherten Klonen zeigten zwei, pBo1.27 (182 Bp) und pBo2.157 (206 Bp), Homologien mit dem En-Spm-Transposon-ähnlichen Element (jeweils 87% und 98% Sequenzidentität). Durch FISH konnte gezeigt werden, dass sie verstreut auf verschiedenen Chromosomen des A- und C-Genoms von Brassica liegen. Die größere Häufigkeit dieser Sequenzen im C-Genom war aber in der Southern-Blot Hybridisierung deutlicher erkennbar als in der FISH, möglicherweise weil die Signale in der FISH Methode mehrfach verstärkt werden mussten.Der dritte Klon, pBo1.6 (203 Bp), zeigte in einer Region von 116-132 Bp bis zu 89% Sequenzidentität mit Telomer-ähnlichen Sequenzen. In der FISH hybridisierte dieser Klon mit den Telomeren/Subtelomeren und den interstitiellen Regionen von allen Chromosomen von B. oleracea, während diese Sequenz in B. rapa in den meisten Zellen keine Hybridisierungssignale zeigte. In B. napus sind beide Typen von Chromosomen (mit und ohne Hybridisierungssignale) gefunden worden. In den meisten Zellen von B. napus waren aber mehr als 18 Chromosomen markiert. Das weist darauf hin, dass pBo1.6 entweder in einige Chromosomen des A-Genoms des Polyploides übertragen und amplifiziert wurde oder dass die schon in geringer Zahl vorhandenen pBo1.6 Sequenzen des A-Genoms selbst amplifiziert wurden.Die Entdeckung einer Sequenz, die im C-Genom von Brassica häufiger vorkommt als im A-Genom, eröffnet eine Gelegenheit zu detaillierten Untersuchungen der auf die interspezifische Bastardierung folgende Evolution der DNA Sequenzen in solchen Polyploiden. In der Angewandten Genetik wird diese Entdeckung möglicherweise die zuverlässige genomische Lokalisierung von transgener DNA in genetisch verändertem Raps ermöglichen.