Methodische Untersuchungen zu Eigenschaften, Nachweis, Reinigung und Antigenität des alpha-Toxins von <i>Clostridium septicum</i>

Abstract

In der Gruppe der Clostridien sind die anaeroben, sporenbildenden Bakterien zusammengefaßt, darunter eine Reihe von Krankheitserregern. Clostridium septicum gehört zu der Gruppe der Erreger des Gasödemkomplexes. Infektionen verlaufen fulminant und sind oft tödlich für Menschen und Tiere. Die letale Komponente im Überstand von C. septicum-Kulturen wird als alpha-Toxin bezeichnet und ist das wichtigste Antigen. Zwei Clostridium septicum-Stämme wurden zur Produktion von alpha-Toxin eingesetzt. Es handelte sich um einen Referenzstamm und einen aus einem lokalen Ausbruch von Geburtsrauschbrand isolierten Feldstamm. Die Identität der Stämme wurde mit konventionellen biochemischen und gaschromatografischen Verfahren, Fluoreszenzserologie und durch die Analyse spezifischer Gensequenzen überprüft. Zur Kultivierung beider ausgewählter toxinproduzierender Stämme wurden Versuche mit verschiedenen Fermentationsverfahren und Inkubationsbedingungen im Göttinger Bioreaktor-System durchgeführt. Optimale Ausbeuten des alpha-Toxins wurden jeweils in diskontinuierlicher Kultur bei pH 7,2 erzielt. Die Ernte der Kulturen erfolgte etwa zwei Stunden nach Wiederanstieg des in den Bakteriensuspensionen kontinuierlich gemessenen Reduktions-Oxidations-Potenzials. Durch eine anschließende zweistufige Kaskadenfiltration erfolgte die Abtrennung der Bakterien vom Kulturüberstand und die Konzentration der Proteine >10 kDa im Kulturüberstand ohne Verluste an toxischer Aktivität. Das alpha-Toxin kann in Mäusetitrationstests nachgewiesen werden. Im Rahmen der Arbeit wurde als Alternative zu dem Tierversuch ein in vitro-Testsystem mit sensitiven Adhäsions-Säugerzellkulturen entwickelt. Die Zelllinie BHK21-BSR/PK5/88, eine Hybridlinie der BHK21-C13-Linie (Baby-Hamster-Nierenzellen), wurde im Vergleich zu fünf anderen Säuger-Zellkulturlinien als die empfindlichste gegen das alpha-Toxin von C. septicum herausgestellt und in einem in vitro-Toxizitätstest etabliert und standardisiert. Die selektierte Zellinie zeichnete sich durch gutes, beständiges Wachstum aus. Das neu entwickelte Zellkulturtestsystem war geeignet zum Nachweis und zur Quantifizierung des alpha-Toxins. Der Erhalt der toxischen Aktivität wurde mittels des Tests untersucht. Die zelltoxischen Eigenschaften des alpha-Toxins gingen in aufgetautem Zustand rasch verloren, blieben jedoch bei Lagerung in gefrorenem Zustand in hohem Maße über Monate hinweg erhalten. Die Verdünnung von Toxinproben in H2O bidest. erbrachte einen besseren Erhalt der Toxizität, als Verdünnungen in Diethanolamin- oder Phosphatpuffer. Die Verluste durch Lyophilisation von konzentrierten Lösungen waren tolerierbar, verdünnte Lösungen verloren erheblich an Toxizität. Das alpha-Toxin des Referenzstammes wurde per Säulenchromatografie in drei chromatografischen Schritten gereinigt. Zwei Formen des alpha-Toxins von 54 kDa resp. 48-50 kDa wurden gelelektrophoretisch und immunologisch nachgewiesen. Das gereinigte alpha-Toxin war hämolytisch, zytotoxisch und mäuseletal. Aus dem C. septicum-Feldstamm wurde im Bioreaktor eine lokalspezifische Vakzine aus toxoidiertem Kulturüberstand hergestellt und in einem Milchviehbetrieb eingesetzt. Auf Basis des oben erwähnten Zellkulturtests wurde ein in vitro-Toxinneutralisationstest entwickelt. Der Antikörpertiter in den Seren der Kühe vor und nach Vakzinierung und in den Seren ihrer Kälber wurde in dem Toxinneutralisationstests geprüft. Die Antikörper konnten reproduzierbar nachgewiesen werden. In den Seren der Muttertiere lagen bereits vor der ersten Vakzinierung Antikörper vor. Bei zwei Dritteln der Kühe erhöhte sich der Antikörpertiter nach der Impfung. In den Seren der Kälber von geimpften Muttertieren konnten ebenfalls Antikörper nachgewiesen werden. Die höchsten Antikörpertiter wiesen Kälber von Muttertieren auf, die bereits in den Seren vor der ersten Impfung einen hohen Antikörpertiter gehabt und auf die Impfung mit einer Erhöhung des Antikörperspiegels reagiert hatten.