Real time course of transmitter release of SSVs and LDCVs; SNARE function analysed in synaptobrevin2 and cellubrevin knock out mice

Abstract

Teil 1Die Freisetzung von Neurotransmittern wird durch die Ca2+-abhängige Exocytose von synaptischen Vesikeln vermittelt, die eine sehr schnelle Kinetik der Transmitterfreisetzung aufweist. Mit Hilfe von Kohlefasern als elektrochemische Detektoren wurde die Freisetzung des Neurotransmitters Serotonin aus kultivierten Retzius-Zellen der Blutegel (Hirudo medicinalis) gemessen. Die Kinetik der amperometrischen Signale gibt den Zeitverlauf der Transmitterfreisetzung und der Diffusion der Moleküle vom Ort der Freisetzung bis zum Detektor wieder. Darauf aufbauend wurde eine explizite Formel, HWDextran = (HWRinger-HWreal) · DRinger/DDextrant + HWreal (wobei HW der halben Breite eines einzelnen amperometrischen Spikes, und D dem Diffusionskoeffizienten der Transmittermoleküle entspricht), abgeleitet, um den realen Zeitverlauf (HW) der Transmitterfreisetzung von SSVs (small synaptic vesicles) und LDCVs (large dense core vesicles) zu berechnen. Dies erfolgte unter Verwendung von Dextran-Molekülen (40000 Da), die den Diffusionskoeffizienten verändern. Der reale Zeitverlauf (Hwreal) der Transmitterfreisetzung aus SSVs liegt bei 198 ms und der Beitrag der Diffusion an der Verbreiterung der Kinetik von individuellen amperometrischen Signalen von SSVs beträgt etwa 20%.Diese Ergebnisse deuten darauf, daß die exocytotische Freisetzung von SSVs nicht spontan erfolgt und daß die Mehrheit der Kinetik von einzelnen amperometrischen Signalen der SSVs hauptsächlich vom realen Zeitverlauf der Transmitterfreisetzung abhängig ist. Der reale Zeitverlauf (Hwreal) der Freisetzung von LDCVs wurde ebenfalls bestimmt und liegt bei etwa 1133 ms. Zudem wurde der Einfluß der Temperatur auf den Freisetzungsprozeß von SSVs ebenfalls untersucht. Die Ergebnisse zeigten, daß mit zunehmender Temperatur die Kinetik der Freisetzung um einen Q10-Wert von 1.77 beschleunigt wurde und zu einer dramatischen Zunahme der Freisetzungsfrequenz um einen Q10-Wert von 6.0 führen kann. Der für den Temperatureffekt auf die Kinetik der amperometrischen Ereignisse verantwortliche, zugrunde liegende Mechanismus kann durch ein in dieser Studie entwickeltes Modell anschaulich interpretiert werden. Es wird angenommen, daß die Größe der Fusionspore sich in zwei Schritten ändert: einem initialen Öffnen der Fusionspore, die sehr schnell, und einer nachfolgenden Expansion dieser Pore, die relativ langsam verläuft. Der erste Schritt dominiert hauptsächlich die Kinetik des Freisetzungsprozesses, während der zweite Schritt der Fusionsporenvergrößerung weniger zu dieser Kinetik beiträgt. Verglichen mit dem ersten Schritt ist die Phase der Porenexpansion empfindlicher gegenüber Temperaturveränderungen, womit die letztendliche Veränderung der Kinetik um nur 1.77fach bei einer Temperaturveränderung um 10 Grad erklärt werden kann.Teil 2SNAREs (soluble NSF-attachment protein receptors) werden generell als zentrale Komponenten des Membranfusionsprozesses angesehen. Während einer Fusion bilden SNAREs (der Vesikel SNARE Synaptobrevin, der SNARE Syntaxin der Plasmamembran und SNAP-25) über ihre SNARE-Motive Komplexe. Obwohl SNAREs intensiv untersucht wurden, ist ihre präzise Rolle im Prozess der Membranfusion unklar. In dieser Studie wurde die Exocytose in den chromaffinen Zellen von Synaptobrevin2 (syb2)- und Cellubrevin (VAMP3, einem Mitglied der Synaptobrevin/VAMP Familie der SNAREs)-defizienten Mäuse untersucht.In Abwesenheit von syb2 bleibt die Exocytose weiter bestehen, jedoch ist die Freisetzungsfreuquenz um 20% verringert. Einzelne versikuläre Fusionsprozesse zeigten normale Charakteristiken der Spikephase, die Dauer des Grundsignals beträgt jedoch das Zweifache im Vergleich zum Wildtyp. Durch die Expression der leichten Kette von TeNT in syb2-/- chromaffinen Zellen wurde die restliche Freisetzung vollständig blockiert. Die verlängerte Dauer des Grundsignals und die verringerte Freisetzungsfrequenz wurden durch die Überexpression des syb2-Proteins vollständig auf den Wildtyp-Zustand rekonvertiert. Jedoch zeigte die Überexpression von Cellubrevin (VAMP3) in syb2-/--Zellen einen gegenteiligen Effekt auf die Dauer des Grundsignals, wobei exogenes VAMP3 diese im Vergleich zum Wildtyp sogar um das Dreifache verlängerte. Die Exocytose in VAMP3-/--Zellen wurde ebenfalls untersucht, wobei kein signfikanter Unterschied zwischen den mutanten Zellen und der Kontrolle in Hinsicht auf die Sekretion und den individuellen Fusionsprozess gefunden wurde. Wir schließen daraus, daß Synaptobrevin-Proteine die Exocytose unterstützen und daß sie funktionell redundant sind. Beide Synaptobrevin-Isoformen (syb2 und VAMP3) sind am Prozess der Fuionsporen-Expansion beteiligt, jedoch üben sie gegensätzliche Effekte in diesem Zustand aus.