Transcriptional Regulation of human Plasminogen Activator Inhibitor-1 Gene Expression by Insulin-like Growth Factor-1, Insulin and Upstream Stimulatory Factor-2

Abstract

PAI-1 hemmt die Umwandlung des Proenzyms Plasminogen in die aktive Protease Plasmin und moduliert proteolytische Prozesse, die mit prethrombotischen Ereignissen, Thrombose und Hypoxie assoziiert sind. Da Insulin-resistente Stadien durch eine Erhöhung des PAI-1 Spiegels charakterisiert sind haben wir die Mechanismen untersucht, welche die IGF-1- und Insulin-abhängige PAI-1- Induktion in HepG2-Zellen vermitteln. Behandlung der HepG2-Zellen mit IGF-1 und Insulin führte zu einer Erhöhung der PAI-1-mRNA, Proteinexpression und PAI-1 Promotor-Luciferase-Konstrukt Aktivität. Die Mutation des Hypoxie-responsiven Elements (HRE), welches den Hypoxie-induzierbaren Faktor-1 (HIF-1) binden kann, hat die IGF-1- und Insulin-abhängige PAI-1-Promotor-Aktivität fast vollständig aufgehoben. Mutationen von E4 und E5 hatten keinen Einfluss auf die IGF-1-abhängige Induktion des PAI-1-Promotor-Konstrukts unter Normoxie; unter Hypoxie wurde der Einfluss von IGF-1 jedoch vollständig aufgehoben. Wir fanden, dass die IGF-1-induzierte PAI-1-Expression mit der Aktivierung von HIF-1 alpha verbunden war. Außerdem erhöhte IGF-1 die HIF-1 alpha-Proteinspiegel und die HIF-1 alpha-DNA-Bindung an das HRE und an die E-Boxen E4 und E5. Die Hemmung der PI(3)K durch LY294002 oder der ERK1/2 durch U0126 reduzierte die HIF-1 alpha-Proteinspiegel, während beide Inhibitoren zusammen den IGF-1 Effekt auf HIF-1 alpha vollständig aufhoben. Transfektionen in HepG2-Zellen mit dominant-negative PDK1 oder TRB3, dass Akt/PKB hemmt, hatte keinen Einfluss, während dominant-negatives Raf-1 den IGF-1 Effekt auf HIF-1 alpha wiederum vollständig aufhob. Somit aktiviert IGF-1 die humane PAI-1- Genexpression durch die Aktivierung der PI(3)K und ERK1/2. Durch spezifische PI(3)K Inhibitoren war die Insulin-abhängige Steigerung der HIF-1 alpha-Proteinspiegel unter Normoxie inhibiert. Ausserdem reduzierte die Überexpression der dominant-negative PDK1 als auch TRB3 die basalen HIF-1 alpha-Proteinspiegel, aber sie zeigten keinen Einfluss auf die Insulin-induzierten HIF-1 alpha- Proteinspiegel. Somit scheint die PAI-1-Expression im Falle von Insulin hauptsächlich über den MAPK Signalweg stattzufinden. Zusätzlich zu HIF-1 wurde die humane PAI-1-Expression über HRE, E4 und E5 induziert durch USF-2. EMSAs zeigten, dass E5 und E4 an USF´s binden und obwohl das HRE zur USF-abhängigen Regulation des PAI-1-Gens beigetragen hat, fand hier keine Bindung statt. Im Gegensatz dazu inhibierte USF-2 die PAI-1-Promotor-Aktivität in primären Rattenhepatocyten, was darauf schliessen lässt, dass die PAI-1- Expression entweder vom Promotor-Kontext oder von der Aktivität von USF, welche zellspezifisch zu sein scheint, abhängig ist. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass IGF-1, Insulin und selbst die Hypoxie-aktivierte PAI-1-Expression durch die Aktivierung der PI(3)K und den MAPK Signalweg über HIF-1 verläuft. Weiterhin wurde eine differenzierte USF-vermittelte Regulation des PAI-1-Gens beschrieben, die eine Zelltyp-spezifische Regulation aufweist.