Veranschaulichung subzellulärer physikalischer Kräfte biochemischen und mechanischen Ursprungs mittels FRET
Insights into the spatiotemporal regulation of the cellular cytoskeleton through applications of FRET
by Miso Mitkovski
Date of Examination:2005-11-03
Date of issue:2005-12-09
Advisor:Prof. Dr. Ralf Ficner
Referee:Prof. Dr. Erwin Neher
Referee:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Ralf Heinrich
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The cellular cytoskeleton is composed of microfilaments, intermediate filaments, microtubules and a host of accessory proteins that control its dynamics during different, cell-type and environment dependent behaviors. The Rho family of small GTPases play a pivotal role in these processes. RhoA, for instance, simultaneously coordinates focal adhesion (FA) and stress fiber formation. The stress fibers are marked by actomyosin based contractile forces, which concentrate at FAs and contribute to the generation of cytoplasmic tension required for proper cell morphology, adhesion or for cell migration. An optical biosensor based on the principles of the Förster resonance energy transfer (FRET) was created to visualize the amount of active, GTP-bound RhoA present, whose biochemical signaling leads up to the generation of force within the cellular cytoskeleton. The biosensor was optimized with a set of alpha helices of successively increasing length functioning as linear extensions for good orientation (LEGO). Thereby, a novel approach for the rational design of a FRET biosensor with high detection sensitivity and dynamic range was introduced. The best RhoA biosensor, LEGO10, reported an increase in FRET efficiency, when RhoA was GDP-bound and inactive, while a decrease in FRET efficiency ensued when constitutively active, GTP-bound RhoA was the predominant form. Transmembrane integrin molecules concentrated at FAs enable indirect contact of the cytoskeleton with the extracellular matrix (ECM) and maintain a continuous bidirectional information flow between the intra- and extracelular environment that regulates gene expression, cell growth, proliferation, and motility. An explanation for this process requires knowledge about the spatiotemporal activity of proteins and signaling cascades involved in the cytoskeleton-ECM interface. During adhesion or motility cells need to coordinate assembly, maintenance and disassembly of contacts with the ECM, which are pivotal in the generation and conductance of force and traction and underly the control of Rho family GTPases. To study these events, an ECM consisting of fluorescently labeled fibronectin (Fn) was created, in which the applied Cy3 and Cy5 fluorophores operate as a donor-acceptor pair for FRET, thus creating the FRETing Matrix. Simultaneous observation of GFP-labeled cytoskeletal components, such as actin, was possible because of sufficient spectral separation to the Cy3 and Cy5 labeling reagents that were chosen as the FRETing Matrix fluorophores. The FRETing Matrix was used to characterize the spatiotemporal exertion of mechanical force during cell adhesion, spreading and migration. Force-induced structural rearrangements in the FRETing Matrix lead to changes in FRET efficiency that were RhoA GTPase dependent and occurred at FAs and below membrane proximal to stress fibers. During initial stages of cell spreading, cell protrusion due to actin polymerization occurred prior to establishment of adhesion sites through which cells subsequently exerted force necessary for establishment of cytoplasmic tension and ultimately for cell polarity. The FRETing Matrix technique was thus established as a continuous imaging force biosensor that rapidly and faithfully reports on the dynamic interaction of cells with their substratum.
Keywords: förster resonance eneregy transfer; FRET; biosensor; design; optical force biosensor; dipole orientation; optimization; force exertion; cell adhesion; Rho GTPase; fluorescence activated cell sorting; FACS; extracellular matrix; ECM; green fluorescent protein; gfp; cfp; venus
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Das zelluläre Cytoskelett besteht aus Mikrofilamenten, intermediären Filamenten, Mikrotubuli und einer Reihe von weiteren Proteinen, die seine von dem Zelltyp und von der Zellumgebung abhängige Dynamik kontrollieren. Proteine, die der Rho GTPase Familie angehören, spielen hierbei eine wichtige Rolle. Die RhoA GTPase, zum Beispiel, koordiniert gleichzeitig die Entstehung von Faserbündeln und fokalen Adhäsionen (FA). Die Faserbündel zeichnen sich durch ihre kontrahierenden, auf Aktomyosin basierenden Kräfte aus, die sich auf FA konzentrieren und damit zur Generation der zytoplasmischen Tension beitragen, die wiederum bestimmend für die Zellmorphologie, Adhäsion und Zellmigration ist. Basierend auf den Prinzipien des Förster Resonanz Energie Transfers (FRET) wurde ein optischer Biosensor konstruiert, um den Umfang aktiver, GTP-gebundener RhoA GTPase zu veranschaulichen, deren biochemiche Aktivität zur Entstehung physikalischer Kräfte im zellulären Cytoskelett führt. Der Biosensor wurde durch den Einsatz von alpha-Helices von sukzessiv wachsender Länge optimiert, die der linearen Extension für gute Orientierung (LEGO) dient. Somit wurde eine Methode für das rationale Design eines FRET Biosensors von hoher dynamischer Sensitivitätsreichweite entwickelt. Der beste RhoA GTPase Biosensor, LEGO10, zeigte einen Anstieg der FRET Effizienz, wenn RhoA in der GDP-gebundenen, inaktiven Form vorlag, während eine Verringerung der FRET Effizienz eintrat, wenn die GTP-gebundene Form von RhoA überwog. In FA enthaltene Integrin Moleküle sind integrale Membranproteine, die einen indirekten Kontakt zwischen dem Cytoskelett und der extrazellulären Matrix (EZM) herstellen, so dass ein kontinuierlicher Informationsaustausch zwischen der intra- und extrazellulären Umgebung stattfindet. Dieser Informationsaustausch ist bedeutsam für die Genexpression, das Zellwachstum, die Proliferation und die Zellmotilität. Um diesen Prozess erklären zu können, muss man die raumzeitliche Aktivitätsverteilung von Proteinen und die an dem bidirektionalen Cytoskelett-EZM Informationsaustausch beteiligten Signalkaskaden verstehen. Während der Zelladhäsion oder Zellmotilität müssen Aufbau, Erhalt und Abbau der Adhäsionskontakte mit der EZM koordiniert werden. Diese Kontakte sind für die Erzeugung und Durchleitung von Zugkräften besonders wichtig und unterstehen der Kontrolle der Rho GTPase Proteinfamilie. Um diese Kräfte näher zu erforschen, wurde eine auf Fibronektin basierende EZM konstruiert, die mit den FRET kompatiblen Cy3 und Cy5 Fluorophoren markiert war, so dass eine FRETing Matrix zustande kam. Gleichzeitig konnten GFP-markierte Cytoskelettkomponenten wie Aktin beobachtet werden, da genügend spektrale Separation zu den Cy3 und Cy5 Fluorophoren bestand. Die FRETing Matrix wurde eingesetzt, um raumzeitliche Aspekte der mechanischen Kraftausübung von Zellen während Adhäsion, Ausbreitung und Migration zu veranschaulichen. Umstrukturierungen innerhalb der FRETing Matrix, verursacht durch Kraftausübung der Zellen, bewirkten Änderungen in deren FRET Effizienz, die Rho GTPase abhängig waren und unterhalb von FA und Faserbündeln stattfanden. In den Anfangsstadien der Zellausbreitung - und zwar bevor die Zelle Adhäsionen zu der EZM etablierte - bildeten sich aufgrund von Aktinpolymerisation Ausstülpungen in der Zellmembran. Zelladhäsionen kamen erst in späteren Stadien der Ausbreitung zustande, durch die dann auch diejenigen Kräfte ausgeübt wurden, die zur Herstellung der innerzellulären Tension und Zellpolarität notwendig sind. Die FRETing Matrix wurde somit als ein Biosensor für die kontinuierliche und schnelle Veranschaulichung von Kräften etabliert, die während der dynamischen Interaktion von Zellen mit der EZM ausgeübt werden.
Schlagwörter: förster resonanz energie transfer; FRET; biosensor; design; optischer kraft-biosensor; dipol orientation; optimierung; kraftausübung; zelladhesion; Rho GTPase; fluoreszenz aktivierte zell-sortierung; extrazelluläre matrix; EZM; grün fluoreszierendes protein; gfp; cfp; venus