Genom- und Transkriptionsanalyse von Bacillus licheniformis DSM13 - einem Organismus mit großem industriellem Potential
Genomic and transcriptional analyses of Bacillus licheniformis DSM13 - an organism of high industrial relevance
by Birgit Veith
Date of Examination:2005-01-25
Date of issue:2006-01-17
Advisor:Prof. Dr. Gerhard Gottschalk
Referee:Prof. Dr. Gerhard Gottschalk
Referee:Prof. Dr. Ruth Schmitz-Sreit
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The Gram-positive soil bacterium Bacillus licheniformis is an organism of high industrial relevance. It is used in technical fermentations to produce large amounts of exoenzymes like proteases or amylases. In order to identify and remove bottlenecks in B. licheniformis-based bioprocesses, it is essential to understand the underlying metabolic pathways. Therefore, the knowledge of its complete genomic sequence is an important prerequisite for detailed physiologic analyses of this organism. In the course of this work, the complete nucleotide sequence of the wild type strain B. licheniformis DSM13/ATCC14580 was sequenced with a 7.45-fold coverage. The single circular chromosome has a total length of 4,222,748 basepairs (bp), an average G+C ratio of 46.2% and codes for 4,286 open reading frames (ORFs), 72 transfer RNAs and 7 ribosomal RNA operons. Comparative analysis of the genomic sequence of B. licheniformis DSM13 showed high functional conservation and co-linearity with respect to its close relative Bacillus subtilis. But some significant differences of the genomic properties were also identified. Many new genes of potential interest for biotechnological applications were found in B. licheniformis, such as proteases, pectate lyases, lipases and various polysaccharide degrading enzymes. With regard to the metabolism, a prominent difference is the existence of the glyoxylic acid shunt comprising the isocitrate-lyase and the malate-synthase. These enzymes enable the organism to metabolize substrates like 2,3-butanediol and acetate, which are typical end products of the overflow metabolism in bacilli during growth on carbohydrate-rich media. Additional differences include the presence of an anaerobic ribonucleotid-reductase and two type I restriction systems. A DNA microarray was constructed by PCR amplification of more than 95% of ORFs larger than 300 bp based on the genomic data of B. licheniformis DSM13/ATCC14580. The metabolism of B. licheniformis during growth on acetate and 2,3-Butanediol as single carbon source was monitored by transcriptional analysis (DNA microarray technology, growth experiments and quantitative real-time RT-PCR). Thereby, the physiological functionality of the glyoxylic acid shunt was verified, proving the validity of the bioinformatic predictions. The complete genome sequence of, and the DNA microarray for B. licheniformis DSM13, presented/described in this thesis, are important genomic tools for the optimization of commercially used B. licheniformis strains and their monitoring during industrial fermentation processes.
Keywords: <i>Bacillus licheniformis</i>; genomic sequence; glyoxylic acid shunt; isocitrate-lyase; malate-synthase; 2;3-butanediol; acetate; anaerobic ribonucleotid-reductase; type I restriction system; DNA microarray; transcriptional analysis; continuous culture
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Bacillus licheniformis ist ein Gram-positiver Organismus von großem industriellem Interesse, welcher in der technischen Fermentation zur Produktion großer Mengen Exoenzyme, wie Proteasen oder Amylasen, eingesetzt wird. Um Engpässe bei diesen auf B. licheniformis basierenden Bioprozessen zu identifizieren und zu beseitigen, ist das Verständnis der metabolischen Stoffwechselwege während des Wachstums unter Verwertung unterschiedlicher Kohlenstoffquellen essentiell. Eine wesentliche Voraussetzung für eine detaillierte physiologische Analyse dieses Organismus stellt somit die Kenntnis seiner vollständigen Genomsequenz dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Genom des Wildtypstammes B. licheniformis DSM13/ATCC14580 mit einer 7,45-fachen Abdeckung sequenziert. Das einzelne zirkuläre Chromosom mit einer Länge von 4.222.748 Basenpaaren (bp) und einem durchschnittlichen G+C Gehalt von 46,2% codiert für 4.286 offene Leserahmen (ORFs), 72 transfer RNAs und sieben Cluster ribosomaler RNA. Die komparative Analyse der Genomsequenzen von B. licheniformis und dem engverwandten Bacillus subtilis 168 zeigt eine hohe funktionelle Konservierung und Co-Linearität der beiden Genome. Es konnten jedoch auch einige signifikante Unterschiede bezüglich der genomischen Eigenschaften entdeckt werden. So wurde eine Vielzahl neuer Gene von potentiellem Interesse für biotechnologische Anwendungen, wie Proteasen, Pektat-Lyasen, Lipasen und diverse Polysaccharid-abbauende Enzyme, identifiziert. Hinsichtlich des Metabolismus erwies sich das Vorhandensein der Gene einer Isocitrate-Lyase und einer Malat-Synthase, welche die Schlüsselenzyme des Glyoxylatzyklus darstellen, als auffällige Abweichung. Diese Enzyme befähigen den Organismus zum Wachstum auf Substraten, wie 2,3-Butandiol und Acetat, bei welchen es sich um typische Endprodukte von Bacilli unter der Verwertung kohlenstoffreicher Nährmedien handelt. Weitere Unterschiede stellen die Identifizierung einer anaeroben Ribonukleotid-Reduktase und zweier Typ I Restriktionssysteme dar. Anhand der Genomdaten von B. licheniformis DSM13/ATCC14580 wurde ein PCR basierter DNA Microarray erstellt, welcher 95% aller ORFs größer 300 bp abdeckt. Mit Hilfe der Transkriptionsanalyse konnte der Metabolismus von Bacillus licheniformis während des Wachstums mit Acetat bzw. 2,3-Butandiol als einziger Kohlenstoffquelle beobachtet und analysiert werden. Die Funktionalität des Glyoxylatzyklus wurde mittels DNA Microarray Technologie, Wachstumsexperimenten und der quantitativen Real-time RT-PCR verifiziert und somit die Gültigkeit der bioinformatischen Voraussagen bestätigt. Mit Hinblick auf eine Optimierung kommerziell genutzter B. licheniformis Stämme, ist mit der vollständigen Genomsequenz von B. licheniformis DSM13/ATCC14580 und dem dazugehörigen DNA Microarray eine viel versprechende Grundlage geschaffen.
Schlagwörter: <i>Bacillus licheniformis</i>; Genomsequenz; Glyoxylatzyklus; Isocitrat-Lyase; Malat-Synthase; 2;3-Butanediol; Acetat; anaerobe Ribonukleotid-Reduktase; Type I Restriktionssystem; DNA Microarray; Transkriptionsanalyse; kontinuierliche Kultur