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Functional gene analysis in cultured vertebrate cells using siRNA mediated gene silencing

dc.contributor.advisorOsborn, Mary Prof. Dr.de
dc.contributor.authorGruber, Jensde
dc.date.accessioned2012-04-16T14:56:36Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:21Zde
dc.date.issued2005-02-23de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-ABAC-9de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-618
dc.description.abstractDie Expression von Genen kann sequenzspezifisch durch small interfering RNAs (engl. kleine interferierende RNAs, siRNAs) in einem als RNA Interferenz (RNAi) bezeichneten Prozeß herunterreguliert werden. Die Anwendung von RNAi Technologie erlaubt die systematische Analyse von Genexpression und Genfunktionen. In dieser Dissertation characterisiere ich RNAi induzierte Phänotypen verschiedener Zielgene in Zelllinien aus Säugetieren. Zudem beschreibe ich neue Aspekte des Designs von siRNAs, die Transfektion mit siRNAs mittels einer neuen Technik und befasse mich mit der Anwendung von RNAi im Zebrafisch Danio rerio.Die Anwendung von RNAi als Mittel zur Klärung von Genfunktionen beinhaltete als Zielgene die humane Endoprotease FACE1, welche indirekt mit dem Hutchinson Gilford Progeria Syndrom (HGPS) in Verbindung steht, das humane Protein Astrin, sowie Proteine der Kinetochore (scc1, smc1, smc3, securin und separase) und Kinesin verwandte Motorproteine (MCAK, TPX2, HSET, KIA0622).Die Zinkfinger Metallprotease prozessiert das Zellkernprotein prelamin A durch endoproteolytische Entfernung der carboxyterminalen 16 Aminosäuren zu reifem lamin A. Die Unterdrückung dieser proteolytischen Spaltung des prelamins A durch RNAi gegen FACE1 resultiert in der Akkumulation von nicht prozessiertem prelamin A und einem deutlichen Phänotyp, der Veränderungen der Zellkernarchitektur, einen mitotischen Arrest und apoptotischen Zelltod beinhaltet. Ähnliche Effekte sind von HGPS Patienten bekannt, in welchen die FACE1 Schnittstelle des prelamin A Proteins durch eine Punktmutation und alternatives Spleissen verlorengeht. Durch RNAi konnte ich außerdem zeigen, dass sowohl astrin als auch eine Reihe weiterer mitoseverwandter Proteine eine essentielle Rolle in der mitotischen Zellteilung spielen.Zusätzlich habe ich demonstriert, dass imperfekte siRNAs sich zur Induktion von RNAi eignen. Diese imperfekten siRNAs sind entweder aus einem selbstkomplementären RNA Gegenstrang (antisense RNA) gegen das lamin A/C Gen oder aus zwei zueinander komplementären antisense RNAs mit individuellen Zielsequenzen auf der lamin A/C mRNA. Das bahnbrechendste Experiment zeigt die Supression zweier Zielgene durch die Transfektion einer imperfekten siRNA, die zusammengesetzt sind aus zwei antisense RNAs mit Zielsequenzen auf unterschiedlichen Genen.Ein erfolgreiches RNAi Experiment hängt wesentlich von der Transfektioneffizienz mit siRNAs ab. In dieser Arbeit demonstriere ich eine neue Transfektionsmethode, basierend auf Pinozytose. Wenn Zellen mit einer hypertonischen Umgebung konfrontiert werden beginnen sie automatisch mit der Pinozytose. Zur Transfektion werden nun siRNAs mit hypertonischem Medium gemischt und auf diese Weise in pinozytotischen Vesikeln in das Zytoplasma der Zellen transportiert. Durch einen osmotischen Schock in hypotonischem Medium werden diese Vesikel gesprengt, die siRNAs gelangen in das Zytoplasma und stehen somit der RNAi Maschinerie zur Verfügung. Erfolgreiche RNAi konnte in verschiedenen Vertebraten, darunter Mensch, Huhn und Maus, demonstriert werden. Die Anwendbarkeit von RNAi in Zebrafisch Embryos wird jedoch durch eine unklare Situation in der wissenschaftlichen Literatur in Frage gestellt, denn Anwesenheit doppelsträngiger RNA Moleküle verursacht unspezifische Effekte in den Embryos. In dieser Arbeit zeige ich die Anwendung von RNAi in Zelllinien des Zebrafisches. Sowohl in Zellen adulten als auch embryonalen Ursprungs führte RNAi zur sequenzspezifischen Supression endogener wie exogener Zielgene ohne unspezifische Effekte.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.htmlde
dc.titleFunctional gene analysis in cultured vertebrate cells using siRNA mediated gene silencingde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedFunktionelle Genanalyse in kultivierten Vertebratenzellen durch siRNA bewirkte Gensupressionde
dc.contributor.refereeFicner, Ralf Prof. Dr.de
dc.date.examination2005-02-10de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstractengGene expression can be silenced in a sequence-specific manner by use of small interfering RNAs (siRNAs) in a process that is known as RNA interference (RNAi). The application of RNAi technologies has the potential to allow the systematic analysis of gene expression and gene function. In this thesis I report novel RNAi-induced phenotypes in mammalian cultured cells for a variety of target genes, and describe some technical aspects of siRNA design, siRNA delivery by a novel method and the application of RNAi in the zebrafish Danio rerio. The application of RNAi as a research tool to unravel gene function included as target genes the endoprotease FACE1, which is indirectly linked to the Hutchinson Gilford Progeria Syndrome, the coiled coil protein astrin, kinetochore associated proteins (scc1, smc1, smc3, securin and separase) and kinesin related motor proteins (MCAK, TPX2, HSET, KIAA0622). The zinc-finger metalloprotease FACE1 processes the nuclear protein prelamin A to mature lamin A by cleaving off the 16 carboxy terminal amino acid residues. Inhibition of this proteolytic cleavage by silencing of FACE1 results in the accumulation of unprocessed prelamin A and a strong phenotype that includes abnormalities in the nuclear architecture, mitotic arrest and apoptosis. Similar effects are known from HGPS patients in which the FACE1 cleavage site is lost by a cryptic splice site on the lamin A sequence. Using RNAi approaches astrin as well as a set of other mitosis related proteins are shown to be essential for progression through mitosis.Furthermore silencing with imperfect RNA duplexes is demonstrated. These duplexes consist either of a single, self complementary antisense RNA molecule against the lamin A/C gene (palindrome) or the duplex is composed of two complementary antisense RNAs with target regions in the lamin A/C sequence (two target site). The most striking experiments show silencing of two target genes by transfection of an imperfect RNA duplex consisting of two antisense RNAs against different targets (dual targeting of lamin A/C and emerin).The successful silencing of a gene depends essentially on the delivery of siRNAs into the target cells. Here I report a novel technique for the transfection of siRNAs by pinocytosis. Cells automatically start pinocytosis when they are confronted with a hypertonic environment. For transfection siRNAs are mixed with an hypertonic medium and reach the cytoplasm of cells in pinocytotic vesicles. Application of an osmotic shock in a hypotonic environment releases the siRNAs which are now accessible for RNAi.RNAi has been shown for a variety of vertebrate species, including mouse, man and chicken. Conflicting results for the zebrafish indicate incompatibility of zebrafish embryos and siRNA. Delivery of dsRNAs into embryos causes non specific effects. In this thesis I show, that application of siRNA in cell lines from adult and embryonic zebrafish leads to sequence specific gene knockdown without nonspecific effects.de
dc.contributor.coRefereeTuschl, Thomas Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerRNA interferenzde
dc.subject.gersiRNAde
dc.subject.gerTransfektionde
dc.subject.gerfunktionelle Genanalysede
dc.subject.engRNA interferencede
dc.subject.engsiRNAde
dc.subject.engtransfectionde
dc.subject.engfunctional gene analysisde
dc.subject.bk42.13 Molekularbiologiede
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-64-3de
dc.identifier.purlwebdoc-64de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWF 200: Molekularbiologiede
dc.identifier.ppn517961954de


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