Isolierung von DNA und Konstruktion einer Metagenombank aus dem Sediment des Flusses Leine: partielle Sequenzierung und Annotation des Metagenoms sowie Analyse der mikrobiellen Diversität

Abstract

Die Isolierung, Klonierung und Sequenzierung von Umwelt-DNA erlaubt eine Charakterisierung eines Standortes bezüglich seiner phylogenetischen und physiologischen Diversität, ohne dass eine häufig schwierige Anreicherung erfolgen muss. In dieser Dissertation wurde eine Probe vom Leinesediment entnommen (Stockhausen, Niedersachsen, Deutschland). Die aus dieser Probe isolierte DNA wurde zum einen zur Herstellung von sogenannten Plasmid- und Cosmid-Metagenombanken genutzt und zum anderen für eine 16S rRNA-Genanalyse herangezogen.Aus der Cosmid-Metagenombank wurden willkürlich 12 Cosmide ausgewählt, deren ca. 40 000 bp große Inserts mit Hilfe von Shotgun -Genbanken sequenziert wurden. Das Cosmid slc_1q enthält DNA eukaryotischen Ursprungs, alle anderen Cosmide enthalten prokaryotische DNA. Mit den erhaltenen Sequenzen wurde ein ORF-Finding durchgeführt. Es konnten 374 ORFs auf den Cosmiden mit der prokaryotischen DNA festgelegt werden. Die Annotation der entsprechenden Genprodukte von 12 Cosmiden der Metagenombank lässt zum einen verschiedene Gencluster mit z. T. experimentell überprüfbarer Funktion erkennen, zum anderen wird deutlich, dass fast der Hälfte der Genprodukte der offenen Leserahmen aufgrund fehlender Ähnlichkeiten zu bislang bekannten Sequenzen keine Funktion zugewiesen werden kann. Im Rahmen der 16S rRNA-Genanalyse wurden 60 archaeelle und 147 bakterielle 16S rRNA-Gensequenzen generiert und anschließend in phylogenetische Stammbäume integriert. Der Vergleich der 16S rRNA-Gene mit den Sequenzen der Datenbanken lässt auf das Vorkommen von Vertretern aus mindestens 11 bakteriellen Phyla und dem archaeellen Phylum der Euryarchaeota schließen. Viele der gewonnenen 16S rRNA-Sequenzen zeigen die größte Ähnlichkeit zu 16S rRNA-Sequenzen von Mikroorganismen, die bislang noch nicht kultiviert werden konnten. Besonders interessant scheint hierbei die Sequenz sl1394, die eine 97 %ige Identität zu der 16S rRNA-Gensequenz des Klons S1G12 zeigt, der in die bislang nur selten nachgewiesene Kandidat-Division TM7 gruppiert ist. Zum Schluss wurde innerhalb eines vollständig sequenzierten Plasmides (pEry1), das aufgrund seines Boden-DNA-Inserts Escherichia coli die Fähigkeit vermittelt, mit Erythrit als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle zu wachsen, ein offener Leserahmen angezeigt, dessen Genprodukt vermutlich für die Verwertung des Erythrits verantwortlich ist. Die Molekülmasse des Enzyms und die spezifische Aktivität in E. coli JM109 wurden ermittelt und die Wachstumsparameter von E. coli JM109 mit pEry1 in Mineralmedium mit Erythrit als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle bestimmt.