Expression, Charakterisierung und Kristallisation der spleißosomalen Proteine SMNrp, U4/U6-60k und U4/U6-90k
Expression, characterisation and crystallisation of the spliceosomal proteins SMNrp, U4/U6-60k and U4/U6-90k
Christos Gouloudis
Doctoral thesis
Date of Examination:
2005-01-26
Date of issue:
2006-01-20
Advisor:
Ficner, Ralf Prof. Dr.
Referee:
Ficner, Ralf Prof. Dr.
Referee:
Braus, Gerhard Prof. Dr.
Persistent Address: http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-ABAE-5
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Name:
gouloudis.pdf
Size:
2,8 MB
Format:
PDF
Description:
Dissertation
Abstract
English
The U4/U6-20k/60k/90k-complex, a component of the U4/U6*U5-snRNP-complex, and SMNrp are involved in the assembly of the human spliceosome. It was suggested that the recruiting of the U4/U6*U5-snRNP-complex to the pre-spliceosome is supported by the binding of SMNrp to 90k. For crystallisation attempts the human proteins 60k, SMNrp, 90k and the generated 90k-fragments were expressed in Escherichia coli and purified.90k was expressed and purified via its N-terminal His-tag. Since the yield was not sufficient, it was produced as MBP-fusion protein. After proteolytic cleavage 90k was further purified. In addition three truncated 90k-fragments were generated (683 amino acids) by means of PCR and designated according to the beginning and final position of their amino acids: 90k(1-174), 90k(1-426) and 90k(175-426). These fragments were expressed as MBP-fusion proteins, purified and cleaved proteolytically. With exception of the 90k(1-174) the other two fragments 90k(1-426) and 90k(175-426) were successfully further purified. Unlike to the so far described proteins, 60k was unsoluble when expressed as GST-fusion protein and as MBP-fusion protein 60k aggregated unspecifically. An other protein which binds to 90k is SMNrp. This was expressed and purified as GST-fusion protein. It could be separated from GST by proteolytic cleavage. The purified proteins were used afterwards for binding studies. The following complexes were reconstituted: SMNrp::90k, SMNrp::90k(1-426), SMNrp::90k(175-426), 60k::90k, 60k::20K. Finally the proteins and protein comple xes were used for crystallisation attempts. Crystals were obtained exclusively from MBP-60k. These crystals could not be used for structure determination.
Keywords: Spliceosome; UsnRNP; SMNrp; U4/U6-60k; U4/U6-90k
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Der U4/U6-20k/60k/90k-Komplex, der Bestandteil des U4/U6*U5-snRNP-Komplexes ist, und SMNrp sind an der Assemblierung des humanen Spleißosoms beteiligt. Es wird vorgeschlagen, dass die Rekrutierung des U4/U6*U5-snRNP-Komplexes zum prä-Spleißosom durch die Bindung des SMNrp an 90k erleichtert wird. Zur Kristallisation wurden die humanen Proteine 60k, SMNrp, 90k und die generierten 90k-Fragmente in Escherichia coli exprimiert und gereinigt.90k wurde mit Hilfe eines N-terminalen His-tags exprimiert und gereinigt. Da die Ausbeute nicht zufrieden stellend war, wurde es als MBP-Fusionsprotein produziert. Nach proteolytischer Spaltung wurde 90k bis zur Homogenität aufgereinigt. Außerdem wurden drei verkürzte Fragmente vom 90k (683 Aminosäuren) mittels PCR generiert und diese entsprechend der Anfangs- und Endposition der Aminosäuren benannt: 90k(1-174), 90k(1-426) und 90k(175-426). Diese Fragmente wurden als MBP-Fusionsproteine exprimiert, affinitätsgereinigt und proteolytisch gespalten. Mit Ausnahme des 90k(1-174) konnten 90k(1-426) und 90k(175-426) weiter gereinigt werden. 60k konnte als GST-Fusionsprotein nur unlöslich exprimiert werden und als MBP-Fusionsprotein aggregierte es jedoch unspezifisch. Ein weiteres 90k-bindendes Protein war SMNrp, das als GST-Fusionsprotein exprimiert und gereinigt wurde. Durch proteolytische Spaltung konnte es vom GST getrennt werden. Die gereinigten Proteine wurden anschließend für Bindungsstudien verwendet. Es konnten folgende Komplexe rekonstituiert werden: SMNrp::90k, SMNrp::90k(1-426), SMNrp::90k(175-426), 60k::90k, 60k::20K. Abschließend wurden die Proteine und Proteinkomplexe für Kristallisationsstudien verwendet. Es wurden ausschließlich vom MBP-60k Kristalle erhalten, die zur Strukturaufklärung nicht geeignet waren.
Schlagwörter: Spleißosom; UsnRNP; SMNrp; U4/U6-60k; U4/U6-90k
