Directed evolution of novel properties starting from HisF of Thermotoga maritima as a structural scaffold

Direkte Evolution von neuen Eigenschaften ausgehend von HisF aus Thermotoga maritima als ein strukturelles Gerüst

by Zhenlian Ling
Doctoral thesis
Date of Examination:2006-01-17
Date of issue:2006-01-24
Advisor:Prof. Dr. Hans-Joachim Fritz
Referee:PD Dr. Andreas Schwienhorst
Referee:Prof. Dr. Ulf Diederichsen
Referee:Prof. Dr. Ivo Feußner
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-621

 

 

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Abstract

English

tHisF, imidazole glycerol phosphate synthase from hyperthermophilic organism T. maritima, with a (ba)8-barrel structure was used as scaffold for directed evolution of enzymes. The thisF gene libraries were constructed in phagemid vector pCANTAB 5E and in expression vector pKK223-3 by partially randomizing target positions in thisF gene. To evolve novel properties from the thisF library, a three-stage approach was adopted. In the first stage, tHisF variants that were able to complement eHisF activity in E. coli auxotroph strain UT860 were drawn out. 32 amino acids mutations were observed.A common mutation F86L was seen in 91 out of 98 tHisF variants. A proposed hypothesis was the residue Phe86 may be critical for the adaptation of hyperthermophilic enzyme tHisF to mesophilic environment. In the second stage, a tHisF mutant (termed HA03) with N'-[(5'-phosphoribosyl) formimino] -5-aminoimidazole-4- carboxamide ribonucleotide isomerase (HisA) activity was isolated from tHisF library by complementing an E. coli auxotroph strain Hfr G6. DNA sequencing of HA03 revealed that it carried ten amino acid exchanges. In the third stage, a transient state analog for target reaction (Aldol condensation) was designed and synthesized for future use in bio-panning to select desired biocatalyst candidates; meanwhile, in attempt to evolve aldolase from tHisF library by genetic selection, dihydrodipicolinate synthase (DHDPS, DapA) was targeted, a DdapA E. coli strain lacking DHDPS gene was constructed for this project, the biochemical assay system for DHDPS activity was established including the synthesis of an unstable substrate.
Keywords: (ba)8 barrel · enzyme engineering · gene library ·genetic complementation · HisF

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tHisF, der Imidazol-Glyzerol-Phosphat-Synthase aus dem hyperthermophilen Organismus T. maritima mit der Struktur einer (βα)8-Barrels, wurde als Gerüst für eine direkte Evolution von Enzymen genutzt. Die thisF-Genbibliotheken wurden durch teilweises Randomisieren von Zielpositionen im thisF-Gen im Phagemid-Vektor pCANTAB 5E und im Expressionsvektor pKK223-3 konstruiert. Um neue Eigenschaften aus der thisF Bibliothek zu evolvieren, wurde ein dreistufiger Ansatz vorgenommen. Auf der ersten Stufe wurden tHisF-Varianten ausgewählt, die in der Lage waren eHisF-Aktivität im auxotrophen E. coli-Stamm UT860 zu komplementieren. 32 Aminosäure-Austausche wurden beobachtet. Eine weit verbreitete Mutation, F86L, wurde in 91 von 98 Varianten von tHisF beobachtet. Eine mögliche Theorie war, dass der Rest Phe86 entscheidend für die Anpassung des hyperthermophilen Enzyms tHisF an die mesophile Umgebung ist. Im zweiten Schritt wurde eine tHisF Mutante (genannt HA03) mit N'-[(5'-phosphoribosyl) formimino] -5-aminoimidazol-4- carboxamidribonukleotid-isomerase (HisA)-Aktivität aus der HisF-Bibliothek durch Komplementation des auxotrophen E. coli Stammes Hfr G6 isoliert. Die Sequenzierung der DNA von HA03 ergab, dass hierbei zehn Aminosäure-Austausche vorlagen. Im dritten Schritt wurde für zukünftige Anwendungen ein Übergangszustands-Analogon für eine Zielreaktion (Aldo1-Kondensation) konstruiert und synthetisiert, um durch bio-panning gewünschte Kandidaten für Biokatalysatoren zu selektieren. In der Zwischenzeit wurde im Bestreben eine Aldolase aus der tHisF-Bibliothek durch genetische Selektion zu evolvieren, die Dihydrodipicolinat Synthase (DHDPS, DapA) ausgewählt. Ein DdapA E. coli-Stamm, bei dem das DHDPS-Gen deletiert ist, wurde für dieses Projekt konstruiert und das System eines biochemischen Assays für DHDPS-Aktivität etabliert samt der Synthese eines unstabilen Substrats.
Schlagwörter: (ba)8 barrel · enzyme engineering · Gen-Bibliothek·genetische Komplementierung· HisF
 
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