Directed evolution of novel properties starting from HisF of <i>Thermotoga maritima</i> as a structural scaffold

Abstract

tHisF, der Imidazol-Glyzerol-Phosphat-Synthase aus dem hyperthermophilen Organismus T. maritima mit der Struktur einer (βα)8-Barrels, wurde als Gerüst für eine direkte Evolution von Enzymen genutzt. Die thisF-Genbibliotheken wurden durch teilweises Randomisieren von Zielpositionen im thisF-Gen im Phagemid-Vektor pCANTAB 5E und im Expressionsvektor pKK223-3 konstruiert. Um neue Eigenschaften aus der thisF Bibliothek zu evolvieren, wurde ein dreistufiger Ansatz vorgenommen. Auf der ersten Stufe wurden tHisF-Varianten ausgewählt, die in der Lage waren eHisF-Aktivität im auxotrophen E. coli-Stamm UT860 zu komplementieren. 32 Aminosäure-Austausche wurden beobachtet. Eine weit verbreitete Mutation, F86L, wurde in 91 von 98 Varianten von tHisF beobachtet. Eine mögliche Theorie war, dass der Rest Phe86 entscheidend für die Anpassung des hyperthermophilen Enzyms tHisF an die mesophile Umgebung ist. Im zweiten Schritt wurde eine tHisF Mutante (genannt HA03) mit N'-[(5'-phosphoribosyl) formimino] -5-aminoimidazol-4- carboxamidribonukleotid-isomerase (HisA)-Aktivität aus der HisF-Bibliothek durch Komplementation des auxotrophen E. coli Stammes Hfr G6 isoliert. Die Sequenzierung der DNA von HA03 ergab, dass hierbei zehn Aminosäure-Austausche vorlagen. Im dritten Schritt wurde für zukünftige Anwendungen ein Übergangszustands-Analogon für eine Zielreaktion (Aldo1-Kondensation) konstruiert und synthetisiert, um durch bio-panning gewünschte Kandidaten für Biokatalysatoren zu selektieren. In der Zwischenzeit wurde im Bestreben eine Aldolase aus der tHisF-Bibliothek durch genetische Selektion zu evolvieren, die Dihydrodipicolinat Synthase (DHDPS, DapA) ausgewählt. Ein DdapA E. coli-Stamm, bei dem das DHDPS-Gen deletiert ist, wurde für dieses Projekt konstruiert und das System eines biochemischen Assays für DHDPS-Aktivität etabliert samt der Synthese eines unstabilen Substrats.