Molecular Characterization of pFGE, the Paralog of the C-α-Formylglycine-generating Enzyme

Abstract

Im aktiven Zentrum von Sulfatasen ist die Seitenkette von Cα-Formylglycin (FGly) die katalytisch aktive Gruppe. In Eukaryonten wird sie durch eine posttranslationale Modifikation der Seitenkette eines in Sulfatasen hoch konservierten Cysteins generiert. Das Enzym, das diese für die Aktivität der Sulfatasen unabdingbare Modifikation katalysiert, wurde kürzlich identifiziert und formylglycine-generating enzyme (FGE) genannt. Genetische Defekte des FGE-Gens (sulfatase-modifying factor-1 gene, SUMF-1) führen zur Multiplen Sulfatasedefizienz (MSD), einer lysosomalen Speicherkrankheit, bei der die Aktivität aller Sulfatasen reduziert ist oder komplett fehlt. Im Genom der Deuterostomia wurde ein Paralog des FGE, genannt pFGE, gefunden. Das humane pFGE ist zu 62,1% homolog und zu 47,1% identisch mit FGE. Seine biologische Funktion ist unbekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die strukturellen und funktionellen Eigenschaften von pFGE zu untersuchen. pFGE zeigt die gleiche Gewebeverteilung wie FGE und ist wie FGE im Lumen des Endoplasmatischen Retikulums lokalisiert. Werden FGE und pFGE in eukaryontischen Zellen überexprimiert, bleibt trotz Fehlen bekannter Retentionssignale ein konstanter Anteil in der Zelle, während der Rest sekretiert wird. Zu weiteren Struktur- und Funktionsuntersuchungen wurde pFGE aus Zellkulturmedien pFGE-überexprimierender Fibroblasten über Ni-NTA-Agarose und Anionenaustauscher-Chromatographie gereinigt und monokloale Antikörper und polyklonale Antiseren für Western-Blot-Analysen hergestellt. Limitierte Proteolyse von gereinigtem FGE und pFGE an analogen Spaltstellen gab Hinweise auf eine ähnliche dreidimensionale Struktur der beiden Proteine. Im Gegensatz zu FGE zeigte pFGE jedoch keine katalytische Aktivität für die Konvertierung von Peptidsubstraten, die von den konservierten Cystein-haltigen Sequenzen aller 16 bekannten humanen Sulfatasen abgeleitet wurden. Jedoch inhibiert pFGE bei Koexpression mit FGE die katalytische Aktivität des FGE. In vitro konnte keine direkte Interaktion mit FGE aber eine Bindung des pFGE an die Peptidsubstrate gefunden werden, was auf eine Kompetition von FGE und pFGE um die neu synthetisierten Sulfatasen im ER als Ursache für die gefundene Inhibition hinweist.In einer weiteren Untersuchung wurde der Effekt der Koexpression von FGE auf die spezifische Aktivität von Sulfatasen getestet, die in großen Mengen für die Enzyme-Replacement-Therapie in Fibroblasten (HT1080) exprimiert werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die spezifische Aktivität von Galactose-6-Sulfatase durch Koexpression von FGE bis zu 100fach gesteigert werden kann. Eine solche Steigerung setzt jedoch die gleichzeitige Expression beider Proteine voraus. In solchen Zellen konnten auch stabile FGE-Sulfatase-Komplexe nachgewiesen werden, deren funktionelle Bedeutung jedoch noch unklar sind. Da die Sekretion von überexprimiertem FGE durch Koexpression von Sulfatase reduziert wird, könnten die FGE-Sulfatase-Komplexe bei der Retention des FGE im ER eine Rolle spielen.