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Molecular mechanisms governing germ line development in zebrafish and the role of this lineage in sexual differentiation

dc.contributor.advisorRaz, Erez Prof. Dr.de
dc.contributor.authorSlanchev, Krasimir Ivanovde
dc.date.accessioned2012-04-16T14:56:40Zde
dc.date.available2013-01-30T23:51:02Zde
dc.date.issued2006-03-17de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-ABB4-6de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-626
dc.description.abstractWährend der Embryonalentwicklung des Zebrafisch (Danio rerio) werden die Urkeimzellen sehr früh von den anderen Zelllinien durch eine maternale, spezifische Form des Cytoplasmas, dem so genannten Keimplasma, unterschieden. Bei den nachfolgenden Zellteilungen verteilt sich dieses Keimplasma asymmetrisch, so dass es jeweils nur in die späteren Keimzellen und nicht in die späteren somatischen Zellen gelangt. Das Keimplasma enthält Schlüsselfaktoren, die das Entwicklungspotential seiner Zellen auf das der Keimzellen festlegen. So ist z.B. die RNS verschiedener Keimzell-spezifischer Gene, wie vasa, nanos1 und dead end (dnd), im Keimplasma angereichert und wird in der Keimbahn expremiert.Das erste Kapitel dieser Arbeit untersucht die zelluläre Lokalisation der Proteine Dead End und Nanos1 während verschiedener Entwicklungsstadien im Zebrafisch. Zu diesem Zweck entwickelten wir polyklonale Antikörper, die diese beiden Proteine detektieren. Dead End und Nanos1 kolokalisieren in den perinukleären Granula, welches Keimzell-spezifische Organellen mit noch unbekannter Funktion sind. In diesen perinukleären Granula sind Proteine angereichert, die von Keimplasma-spezifischen Genen kodiert werden. Eine genauere Charakterisierung dieser Organellen zeigte, dass sie in unmittelbarer Nähe zu den Zellkernporen lokalisiert sind. Wir stellen daher die Hypothese auf, dass Komponenten der perinukleären Granula an der posttranskriptionalen Regulation der Genexpression, wie z.B. mRNS- Stabilisierung, - Transport und/oder - Abbau, beteiligt sein könnten. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese konnten wir zeigen, dass loss-of-function Punktmutationen in dead end dazu führen, dass das Dead End Protein nicht mehr in den perinukleären Granula sondern im Zellkern lokalisiert ist.Das zweite Kapitel dieser Arbeit behandelt die Rolle von dead end in der Geschlechtsdeterminierung. Embryonen, in die ein Morpholino injiziert wurde, der die Translation von dead end blockiert, besitzen keine Keimzellen. Darüber hinaus entwickeln sich diese Embryonen ausschließlich zu sterilen Männchen. Dies lässt vermuten, dass für die Geschlechtsdeterminierung im Zebrafisch entweder funktionales Dead End Protein oder das Vorhandensein von Keimzellen essentiell ist. Um zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, wurde eine alternative Methode zur Entfernung von Keimzellen angewandt. Diese Methode basiert auf dem bicistronischen Toxin-Antidote-System, welches die Expression eines Giftes (Toxin) in den Keimzellen ermöglicht während die somatischen Zellen durch ein Gegengift (Antidote) geschützt sind. Keimzelllose Embryonen, die durch diese dead end unabhängige Methode erzeugt wurden, entwickelten sich ebenfalls überwiegend zu Männchen. Dies zeigt, dass die Existenz von Keimzellen wichtig für die Geschlechtsdeterminierung im Zebrafisch ist.Das letzte Kapitel dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle von RNS-Interferenz während der Keimzellentwicklung im Zebrafisch. RNS-Interferenz ist ein in vielen Organismen verbreiteter Mechanismus zum Ausschalten von Genen. Über die Existenz von RNS-Interferenz im Zebrafisch gibt es jedoch nur wenige und widersprüchliche Daten. Da das Ausschalten von Genen während der Keimzellentwicklung in verschiedenen Organismen sehr häufig beobachtet wird, untersuchten wir, ob die Funktion von small interfering RNAs (siRNAs) und micro RNAs (miRNAs) wichtig für die Spezifizierung und Entwicklung von Keimzellen im Zebrafisch ist.Unsere Ergebnisse zeigen, dass beiden Prozesse, die Hemmung von Translation durch miRNA und der siRNA vermittelter Abbau von mRNS, ein unterschiedliches Potential zur Ausschaltung von Genen besitzen. Die Anwendung von siRNAs führte gelegentlich zu einem Abbau von mRNS, wobei die Effizienz des Abbaus von Gen zu Gen variierte. Die miRNA Oligonukleotide könnten benutzt werden, um spezifische Gensequenzen an genau definierten Positionen auszuschalten. Die genauen Anforderungen an diese Zielsequenzen können jedoch bislang noch nicht genau definiert werden. Dieses beschränkte Wissen bezüglich der erfolgreichen Voraussage von miRNA-Bindungsstellen erschwert den Gebrauch dieser Technik im Zebrafisch. Dies gilt vor allem im Vergleich zu gut etablierten Techniken wie Morpholino-antisense-Oligonukleotiden, die zur Hemmung der Translation von mRNS eingesetzt werden. Da wir die Existenz von RNS-Interferenz zur Regulation von endogenen Genen nicht nachweisen konnten, weder in somatischen noch in Keimzellen, bleibt die Frage offen, ob RNS-Interferenz die Genregulation in einer dieser beiden Zellpopulationen regelt.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.htmlde
dc.titleMolecular mechanisms governing germ line development in zebrafish and the role of this lineage in sexual differentiationde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedMolekulare Mechanismen zur Steuerung der Keimzellentwicklung in Zebrafisch und die Rolle dieser Zelllinie in der Geschlechtsdifferenzierungde
dc.contributor.refereeWimmer, Ernst A. Prof. Dr.de
dc.date.examination2005-04-26de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstractengPrimordial germ cells (PGCs) in zebrafish are specified early in the development by inheritance of a specific type of cytoplasm termed germ plasm. The asymmetrically distributed germ plasm contains factors that direct cells to assume the fate of a germ cell. RNAs of several genes, such as vasa, nanos1 and dead end are enriched in the germ plasm and together with the encoded proteins are expressed in the germline.The first chapter of this thesis concerns the protein localization of Dead end and Nanos1 during different developmental stages. To address this question we generated polyclonal antibodies against the two proteins. Both antibodies co-localize to the perinuclear granules, a germ cell specific organelle with unknown function. Further characterization of the perinuclear granules show that they are positioned adjacent to the nuclear pores. We hypothesize that some of the components of the perinuclear granules might be involved in posttranscriptional regulation of gene expression such as mRNA protection, transport and/or degradation. In accordance with this hypothesis loss of function point mutation in dead end altered its protein localization from the perinuclear granules to the nucleus. Chapter two of the thesis addresses the role of Dead end in sex determination. Embryos injected with a Morpholino that blocks the translation of dnd loose the germ cells. Furthermore, these embryos develop exclusively into sterile male adults. This suggests that sex determination in zebrafish may either involve Dead end function or depend on the presence of germ cells. To discriminate between these two possibilities an independent method for germ cell ablation was applied. The method was based on bi-cistronic toxin-antidote system, which allowed expression of the toxin in the germ cells while protecting the somatic cells with an antidote. Germ-cell-less embryos generated by this dead end independent method also exhibited a male biased sex ratio, showing that germ cells are important for sex determination of zebrafish.The last chapter deals with the role of RNA interference in germ cell development in zebrafish. RNA interference is a widely used method for gene silencing in many organisms. In zebrafish however, only partial and controversial data regarding the function of RNA interference exists. As gene silencing is a common theme in germline development of many organisms, we investigated if small interfering RNAs and micro RNAs function in Danio rerio are important for germline specification and development. Our results demonstrate that the two sides of the processes, miRNA translational inhibition and siRNA mediated mRNA degradation, exhibit different potential for gene silencing in zebrafish. miRNA oligos could be used for targeting specific sequence at strictly defined positions with a not well determined sequence requirements. siRNAs produce occasional, gene dependent, reduction of the mRNA levels. Yet, the limited knowledge regarding successful prediction of miRNA-binding sites makes the use of this technology in zebrafish more challenging especially when compared to the well-established technology of using morpholino antisense oligonucleotides for inhibiting mRNA translation. As we failed to demonstrate RNAi of endogenous genes both in somatic and in germ cells, we could not draw any conclusion regarding the possibility that RNAi regulates gene expression in either one of these two cell populations.de
dc.contributor.coRefereeFeussner, Ivo Prof. Dr.de
dc.contributor.thirdRefereeGradmann, Dietrich Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerZebrafischde
dc.subject.ger<i>Danio rerio</i>de
dc.subject.gerKeimzellende
dc.subject.gerKeimplasmade
dc.subject.gerdead endde
dc.subject.engzebrafishde
dc.subject.eng<i>Danio rerio</i>de
dc.subject.enggerm cellsde
dc.subject.enggerm plasmde
dc.subject.engdead endde
dc.subject.bk42de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-681-7de
dc.identifier.purlwebdoc-681de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWK 000: Entwicklungsbiologiede
dc.identifier.ppn512657033de


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