Charakterisierung eines Proteinkomplexes in Säugerzellen, der am Transport zwischen Membrankompartimenten beteiligt ist.

Abstract

Intrazellulärer Transport vermittelt die Verteilung von Proteinen und Lipiden zwischen verschiedenen Kompartimenten. Dazu werden Vesikel vom Donorkompartiment abgeschnürt und zur Akzeptormembran transportiert, mit der sie fusionieren. Als zusätzlichen Weg betrachtet man den Transport in Form von Membrantubuli.SNARE Proteine erfüllen eine grundlegende Funktion beim Andocken und bei der Fusion zweier Organelle. Sie lagern vier alpha-Helices zu einem stabilen, parallelen Helixbündel zusammen, das die Fusion von Lipiddoppelschichten erleichtert. In der vorliegenden Arbeit wurde ein SNARE-Komplex in Säugerzellen untersucht, dessen homologe Proteine in Hefe nachweislich am retrograden Transport vom Golgi Apparat zum ER beteiligt sind. Der Komplex müsste analog zur Hefe aus folgenden SNAREs bestehen: mSec22b als R-SNARE und Syntaxin18, mUse1 und mSec20 als Q-SNAREs. Obwohl ein solcher Komplex von der 1R-3Q Regel abweicht, die zuvor für andere SNARE-Komplexe beschrieben wurde, konnte er in dieser Arbeit durch Fluoreszenzmessungen an lebenden Zellen (FRET und BiFC) und Koimmunpräzipitation nachgewiesen werden.Am Golgi-Apparat wird der Abtransport bestimmter Moleküle zum ER über den COPI-Adaptorkomplex und dessen Bindungspartner reguliert. Fehlgeleitete Proteine aus dem ER, die ein KDEL-Motiv am C-Terminus tragen, werden im Golgi durch den KDEL-Rezeptor Erd2 gebunden und zum ER zurücksortiert. Der Rezeptor wandert durch COPI-abhängigen Transport zwischen dem Golgi und dem ER. FRET-Messungen ergaben in dieser Arbeit, dass mSec22b, mUse1 und mSec20 jeweils an Erd2 binden. Ausserdem wurden mSec22b und Use1 durch Elektronenmikroskopie in COPI-Vesikeln nachgewiesen, die in einem zellfreien Assay aus dem Golgi entstanden waren. Antikörper gegen mUse1 präzipitierten auch beta´-COP (eine Untereinheit von COPI) und den KDEL-Rezeptor. Schliesslich konnte ich mit Hilfe der Expression von Choleratoxin als exogenem Frachtmolekül für den KDEL-Rezeptor zeigen, dass der retrograde Transport vom Golgi zum ER gestört wird, wenn man die Menge an mSec22b durch siRNA erniedrigt.Meine Ergebnisse weisen insgesamt stark auf eine Beteiligung der SNAREs mSec22b, mUse1, mSec20 und Syntaxin18 an mehreren Schritten des retrograden Transports zwischen Golgi und ER in Säugerzellen hin.