Biochemical and cell biological analysis of the mechanism of RNA interference in human cells

Abstract

RNA-Interferenz (RNAi) wird in menschlichen Zellen durch kurze, aus 19-24 Basenpaaren bestehende, interferierende RNA (siRNA) Duplexe ausgelöst, welche die doppelsträngigen Vorläufer der endogenen microRNAs (miRNAs) imitieren. Einzelsträngige siRNAs und miRNAs werden in Argonaute-Proteine enthaltende, sogenannte RNA-Silencing-Komplexe eingebaut, welche die Inaktivierung der komplementären mRNAs durch Spaltung oder durch translatorische Hemmung vermitteln. Es gibt acht Argonaute-Proteine, die im Menschen exprimiert sind und unterteilt diese in die Ago- und die Piwi-Subfamilie, die jeweils vier Mitglieder enthalten. Nur eines der Ago-Proteine ist zur siRNA/miRNA-geleiteten Spaltung von nahezu komplementären Ziel-RNAs imstande, wohingegen alle vier Ago-Subfamilienmitglieder die Translation partiell komplementärer mRNAs hemmen. miRNAs regulieren die Expression etwa eines Drittels aller menschlichen Gene. Die Rolle der Säugetier Piwi-Proteine im RNA-Silencing-Prozess ist noch ungeklärt. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem RNAi-Mechanismus im Menschen, insbesondere der Funktion der zwei Schlüsselkomponenten des RNA-Silencing-Prozesses: kleiner RNAs und den Argonaute-Proteinen.Um das Schicksal kleiner RNAs im menschlichen Zelllysat, welches die Ziel-RNA Spaltungsaktivität rekapituliert, zu untersuchen, wurde die Stabilität und die Prozessierung radioaktiv markierter einzel- und doppelsträngiger RNA experimentell überwacht. Die RNA-Duplexe waren im Extrakt stabil und deren Enden wurden zu 5'-Phosphat- und 3'-Hydroxylgruppen konvertiert, ähnlich der Struktur der Zwischenprodukte langer dsRNA Prozessierung. Einzelsträngige siRNAs wurden rasch abgebaut. Die Wirksamkeit der 5'-phosphorylierten einzel- und doppelsträngigen siRNA wurde anschliessend in Zellkulturen getestet. Die einzelsträngigen siRNAs waren ausreichend, um RNAi in den kultivierten Zellen auszulösen. Das deutet darauf hin, dass obwohl die siRNA-Duplexe die bevorzugten Auslöser der RNAi sind, einzelsträngige siRNAs die normale Bildung des RNA-Silencing-Komplexes überbrücken können, insbesondere wenn diese 5'-phosphoryliert sind.Um das Expressionsmuster der Argonaute-Proteine in menschlichen Zelllinien zu untersuchen, wurden die Expressionsmengen einzelner Transkripte durch qRT-PCR quantifiziert. Exprimierte Ago-Subfamilienmitglieder wurden in mehreren menschlichen Zelllinien gefunden, während Piwi-Proteine nur im Hoden- und Eierstockgewebe nachgewiesen werden konnten. Ferner wurde gezeigt, dass miRNAs, unbesehen ihrer Sequenz, in die unterschiedlichen Silencing-Komplexe inkorporiert werden, die Ago-Proteine enthalten. Die eingeschränkte Expression der Piwi-Proteine ist in Übereinstimmung mit Berichten über deren Keimbahn-Expression in Mäusen und impliziert eine Beteiligung des RNA-Silencings in Keimbahn-spezifischen Prozessen im Menschen. Um zu überprüfen, ob die Piwi-Proteine RNA-Spaltung ausführen können, wurden mit FLAG/HA-markierte Piwi-Proteine ektopisch exprimiert, gereinigt und mit kleinen RNAs beladen. Keines der Piwi-Proteine war unter den getesteten Bedingungen katalytisch aktiv. Um eine Untersuchung der Rolle der Piwi-Proteine im Hodengewebe zu ermöglichen, wurden einzelne Piwi-spezifische Antikörper herangezogen und charakterisiert.