Untersuchungen zur genetischen Regulation der CO2-Assimilation in Ralstonia spp.
Investigations into the genetic regulation of CO2 assimilation in Ralstonia spp.
von Caroline Höfle
Datum der mündl. Prüfung:2005-11-02
Erschienen:2006-05-02
Betreuer:Prof. Dr. Botho Bowien
Gutachter:Prof. Dr. Axel Zeeck
Gutachter:Prof. Dr. Wolfgang Liebl
Gutachter:Prof. Dr. Petr Karlovsky
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Autotrophic CO2 assimilation in Ralstonia eutropha H16 and Ralstonia metallidurans CH34 involves the enzymes of the Calvin-Benson-Bassham (CBB) cycle. The expression of the two highly homologous cbb operons, cbbc and cbbp, in R. eutropha H16 is mainly controlled by the LysR type transcriptional regulator CbbR. The sigma70-dependent promoters of the cbb operon (pcbbL) and the cbbRgene (pcbbR) had been already verified within the cbb control region in earlier studies. Binding experiments with the cbb operator, site-directed mutageneses and activity determinations of pcbbL in wild type strain H16 and a cbbR deletion mutant suggested that the cbb expression is controlled by at least one additional regulator.To investigate the cbbgene regulation in R. eutropha H16 homologous regulator genes of CO2 fixation in other bacteria, like the two-component system RegBA, were deleted. Additional potential cbb regulators were isolated by DNA affinity chromatography using the cbb control region and by binding interaction with CbbR employing a two-hybrid system. Deletion mutants of the corresponding genes showed no alteration of the autotrophic phenotype. The gene frcR, encoding one of the proteins isolated by DNA affinity chromatography and belonging to the ROK family of transcription regulators, forms an operon together with the genes of a potential fructose transporter system, a sugar kinase, a glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) and a phosphoglucose isomerase (PGI). Activities of G6PD and PGI were elevated in a frcR deletion mutant, but still depended on the specific growth conditions. Thus, FrcR seems to be a repressor of the frcoperon which probably is controlled by at least one additional regulator. In contrast there was no significant influence of FrcR on the regulation of the cbbgenes.Activator CbbR is essential for cbbgene expression in R. eutropha H16. However its activating function is inhibited by binding the negative effector phosphoenolpyruvate, a signal metabolite of the central carbon metabolism. Site-directed mutageneses of CbbR suggested a structural function of the amino acid residues A175 and W274 and a role of residues G203, G205 and R135 in the effector binding, confirming the differential function of CbbR. A cbbR gene is encoded immediatly upstream of each of the two heterologous cbb operons (cbbI and cbbII) of R. metallidurans CH34. It was shown that CbbRI as well as CbbRII bind to the two cbb control regions. A cbbRII deletion mutant exhibited strongly reduced autotrophic growth, suggesting preferential regulation of the cbb operons by their associated CbbR proteins. These findings indicate significant differences in cbb gene regulation in these two related organisms.
Keywords: Calvin-Benson-Bassham cycle; CO<sub>2</sub> assimilation; cbb operon regulation;LysR type transcription regulator;deletion mutant; site specific mutagenesis; Ralstonia eutropha H16; Ralstonia metallidurans CH34
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Die autotrophe CO2-Assimilation erfolgt in Ralstonia eutropha H16 und Ralstonia metallidurans CH34 über den des Calvin-Benson-Bassham (CBB) Cyclus. Die Expression der beiden hoch homologen cbb-Operone cbbc und cbbp in R. eutropha H16 wird in erster Linie durch den LysR-Typ-Transkriptionsregulator CbbR reguliert. Die sigma70-abhängigen Promotoren des cbb-Operons (pcbbL) und des Regulatorgens cbbR (pcbbR) waren zwar bereits in der cbb-Kontrollregion verifiziert worden. Bindungsexperimente mit dem cbb-Operator, gerichtete Mutagenesen und Aktivitätsmessungen des pcbbL im Wildtyp H16 und einer cbbR Deletionsmutante wiesen auf mindestens einen weiteren Regulator der cbb-Expression hin.Zur Untersuchung der cbb-Regulation wurden in R. eutropha H16 homologe Gene von Regulatoren der CO2-Fixierung in anderen Bakterien, wie das Zwei-Komponenten-System RegBA, deletiert. Weitere potentiell an der Regulation der cbb-Gene beteiligte Proteine wurden mittels DNA-Affinitätschromatographie mit einem DNA-Fragment der cbb-Kontrollregion und anhand der Wechselwirkung mit CbbR durch ein Zwei-Hybrid-System identifiziert. Deletionsmutanten der korrespondierenden Gene zeigten aber keine Veränderung des autotrophen Phänotyps. Das Gen frcR eines in der DNA-Affinitätschromatographie isolierten Proteins der ROK-Familie von Transkriptionsregulatoren bildet zusammen mit den Genen eines potentiellen, für Fructose spezifischen Transporters, einer Zucker-Kinase, einer Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PD) und einer Phosphoglucose-Isomerase (PGI) ein Operon. In einer frcR-Deletionsmutante waren die Aktivitäten der G6PD und der PGI deutlich erhöht, zeigten aber weiterhin eine Abhängigkeit von den jeweiligen Wachstumsbedingungen. FrcR scheint demnach ein Repressor des frc-Operons zu sein, an dessen Expression wahrscheinlich mindestens ein weiterer Regulator beteiligt ist. Ein deutlicher Einfluß von FrcR auf die cbb-Regulation konnte dagegen nicht festgestellt werden. Der Aktivator CbbR ist für die Expression der cbb-Gene in R. eutropha H16 essentiell, wird aber in seiner aktivierenden Funktion durch den negativen Effektor Phosphoenolpyruvat, einem Signalmetaboliten aus dem zentralen Kohlenstoffwechsel, gehemmt. Gerichtete Mutagenesen von CbbR wiesen auf eine strukturelle Funktion der Aminosäurereste A175 und W274 und auf eine Rolle der Reste G203, G205 und R135 bei der Effektorbindung hin und bestätigen damit seine differenzierte Funktion.Unmittelbar vor den beiden heterologen cbb-Operonen (cbbI und cbbII) von R. metallidurans CH34 ist jeweils ein cbbR-Gen codiert. Es wurde gezeigt das sowohl CbbRI als auch CbbRII an die cbb-Kontrollregionen beider Operone binden. Eine cbbII-Deletionsmutante wies ein erheblich verlangsamtes autotrophes Wachstum auf, was auf eine präferentielle Regulation der cbb-Operone von R. metallidurans CH34 durch das jeweils assoziierte CbbR hindeutete. Diese Befunde sprechen für erhebliche Unterschiede in der cbb-Genregulation in den beiden verwandten Organismen.
Schlagwörter: Calvin-Benson-Bassham (CBB) Cyclus; CO<sub>2</sub>-Assimilation; cbb-Operon Regulation; LysR-Typ Transkriptionsregulator; Deletionsmutanten; ortsspezifische Mutagenese; Ralstonia eutropha H16; Ralstonia metallidurans CH34