Untersuchungen zur genetischen Regulation der CO₂-Assimilation in <i>Ralstonia</i> spp.

Abstract

Die autotrophe CO2-Assimilation erfolgt in Ralstonia eutropha H16 und Ralstonia metallidurans CH34 über den des Calvin-Benson-Bassham (CBB) Cyclus. Die Expression der beiden hoch homologen cbb-Operone cbbc und cbbp in R. eutropha H16 wird in erster Linie durch den LysR-Typ-Transkriptionsregulator CbbR reguliert. Die sigma70-abhängigen Promotoren des cbb-Operons (pcbbL) und des Regulatorgens cbbR (pcbbR) waren zwar bereits in der cbb-Kontrollregion verifiziert worden. Bindungsexperimente mit dem cbb-Operator, gerichtete Mutagenesen und Aktivitätsmessungen des pcbbL im Wildtyp H16 und einer cbbR Deletionsmutante wiesen auf mindestens einen weiteren Regulator der cbb-Expression hin.Zur Untersuchung der cbb-Regulation wurden in R. eutropha H16 homologe Gene von Regulatoren der CO2-Fixierung in anderen Bakterien, wie das Zwei-Komponenten-System RegBA, deletiert. Weitere potentiell an der Regulation der cbb-Gene beteiligte Proteine wurden mittels DNA-Affinitätschromatographie mit einem DNA-Fragment der cbb-Kontrollregion und anhand der Wechselwirkung mit CbbR durch ein Zwei-Hybrid-System identifiziert. Deletionsmutanten der korrespondierenden Gene zeigten aber keine Veränderung des autotrophen Phänotyps. Das Gen frcR eines in der DNA-Affinitätschromatographie isolierten Proteins der ROK-Familie von Transkriptionsregulatoren bildet zusammen mit den Genen eines potentiellen, für Fructose spezifischen Transporters, einer Zucker-Kinase, einer Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PD) und einer Phosphoglucose-Isomerase (PGI) ein Operon. In einer frcR-Deletionsmutante waren die Aktivitäten der G6PD und der PGI deutlich erhöht, zeigten aber weiterhin eine Abhängigkeit von den jeweiligen Wachstumsbedingungen. FrcR scheint demnach ein Repressor des frc-Operons zu sein, an dessen Expression wahrscheinlich mindestens ein weiterer Regulator beteiligt ist. Ein deutlicher Einfluß von FrcR auf die cbb-Regulation konnte dagegen nicht festgestellt werden. Der Aktivator CbbR ist für die Expression der cbb-Gene in R. eutropha H16 essentiell, wird aber in seiner aktivierenden Funktion durch den negativen Effektor Phosphoenolpyruvat, einem Signalmetaboliten aus dem zentralen Kohlenstoffwechsel, gehemmt. Gerichtete Mutagenesen von CbbR wiesen auf eine strukturelle Funktion der Aminosäurereste A175 und W274 und auf eine Rolle der Reste G203, G205 und R135 bei der Effektorbindung hin und bestätigen damit seine differenzierte Funktion.Unmittelbar vor den beiden heterologen cbb-Operonen (cbbI und cbbII) von R. metallidurans CH34 ist jeweils ein cbbR-Gen codiert. Es wurde gezeigt das sowohl CbbRI als auch CbbRII an die cbb-Kontrollregionen beider Operone binden. Eine cbbII-Deletionsmutante wies ein erheblich verlangsamtes autotrophes Wachstum auf, was auf eine präferentielle Regulation der cbb-Operone von R. metallidurans CH34 durch das jeweils assoziierte CbbR hindeutete. Diese Befunde sprechen für erhebliche Unterschiede in der cbb-Genregulation in den beiden verwandten Organismen.