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dc.contributor.advisor Kramer, Wilfried PD Dr. de
dc.contributor.author Hennecke, Gerrit de
dc.date.accessioned 2012-04-16T14:56:44Z de
dc.date.available 2013-01-30T23:51:02Z de
dc.date.issued 2006-05-16 de
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-ABBE-1 de
dc.description.abstract Das periplasmatische, als Peptidyl-Prolyl Isomerase (PPIase) und Chaperon charakterisierte Protein SurA aus Escherichia coli ist an der Reifung von trimeren Porinen der äußeren Membran beteiligt. Das Protein ist aus drei Regionen aufgebaut: der N-terminalen Region, zwei aufeinander-folgenden Parvulin-ähnlichen PPIase-Domänen (PI und PII) und einer kurzen C-terminalen Sequenz. Die PPIase-Aktivität ist in der PII-Domäne, die Chaperon-artige Aktivität in den N- und C-terminalen Regionen lokalisiert. Der surA-Phänotyp zeichnet sich durch eine destabilisierte äußere Membran aus, verursacht durch einen verringerten Gehalt an outer membrane proteins. Im Gegensatz zu anderen molekularen Chaperonen bindet SurA Substrate selektiv, so z.B. in vitro synthetisierte Porine der äußeren Membran. Zu dem molekularen Mechanismus dieser selektiven Substraterkennung ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit sollte die molekulare Basis der Interaktion zwischen SurA und seinen natürlichen Substraten nachgegangen werden. Dazu wurden zum einen Peptid-Bibliotheken natürlicher Substrate nach SurA-bindenden Peptiden durchmustert und bindende Abschnitte in die native Struktur der Substrate projiziert, zum anderen Experimente zur Lokalisation von Substrat-bindenden Bereichen auf der Oberfläche von SurA durchgeführt. Zellulose-gebundene Peptide-Bibliotheken der nativen SurA-Substrate LamB, OmpF und OmpA wurden mit Wildtyp-SurA bzw. mit SurAN+ICt, einer SurA-Variante, der die aktive PPIase-Domäne PII fehlt, auf Bindung durchmustert. Mittels surface plasmon resonance (SPR) und Fluoreszenzspektroskopie wurde bestätigt, dass ein SurA-bindendes Peptid (Peptid 46 der LamB-Bibliothek) mit signifikant höherer Affinität an SurA bindet als ein nicht bindendes Peptid (Peptid 71 der LamB-Bibliothek). Die Affinität des Peptides 46 für SurA wurde mit einer KD von 3 9 µM bestimmt und die Spezifität dieser Bindung durch fluoreszenzspektroskopische Kompetitionsstudien verifiziert. Als charakteristische Merkmale SurA-bindender Peptide wurden (i) spezifische Muster aromatischer Aminosäuren Ar-x-Ar und Ar-Ar (mit Ar = F, W, Y oder H und x = beliebige Aminosäure) mit einer weiteren, flankierenden aromatischen Aminosäure im Abstand von maximal sieben Aminosäuren sowie (ii) die Ausrichtung ihrer aromatischen Seitenketten zwei Seitenketten auf der gleichen und idealerweise eine weitere Seitenkette auf der gleichen oder gegenüberliegenden Seite des Peptides identifiziert. Das gemeinsame Auftreten beider Merkmale ist charakteristisch für integrale Proteine der äußeren Membran und kann daher als entscheidendes Kriterium der selektiven Substraterkennung und -bindung durch SurA gewertet werden.Die Lokalisierung identifizierter, SurA-bindener Peptide in den nativen Strukturen der Proteine LamB und OmpF zeigte, dass zahlreiche putative Bindestellen in den Trimer-Kontaktflächen, jedoch nur wenige in den Membran-exponierten Bereichen der Trimere liegen. Im Einklang mit bisherigen Erkenntnissen zur Reifung und Membraninsertion der Proteine der äußeren Membran konnte auf Basis einer derartigen Besetzung der Porin-Faltungsintermediate durch SurA erstmals ein mechanistisch und energetisch schlüssiges Arbeitsmodel zur Rolle von SurA in diesen Prozessen aufgestellt werden. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Identifizierung einer Substratbindestelle in SurA mittels electron paramagnetic resonance unter Verwendung zuvor identifizierter SurA-bindender Peptide. Durch ortspezifische Mutagenese wurden Cysteine in verschiedenen, exponierten Positionen des SurA-Moleküls eingebracht und über Thiolkopplung kovalent mit der Radikalsonde MTTSL verknüpft. Auf diese Weise konnten MTSSL-Sonden an drei Positionen des SurA-Moleküls immobilisiert werden. Die Chaperon-artige Aktivität des SurA-Proteins blieb durch die Cys-Substitutionen und die MTSSL-Sonde in diesen Positionen unbeeinflusst. Der aus den EPR-Spektren hervorgehende Immobilisierungsgrad der Sonden war im Einklang mit der bekannten SurA-Kristallstruktur. Jedoch war in Anwesenheit löslicher, SurA-bindender Peptide keine verminderte Mobilität der Sonden erkennbar, so dass bisher keine Hinweise auf den Ort der Substratbindung in SurA gewonnen werden konnten. de
dc.format.mimetype application/pdf de
dc.language.iso ger de
dc.rights.uri http://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html de
dc.title Zur Substratspezifität und Substratbindung des periplasmatischen Chaperons SurA aus <i>Escherichia coli</i> de
dc.type doctoralThesis de
dc.title.translated Substrate specficity and substrate binding of the periplasmic chaperone SurA from <i>Escherichia coli</i> de
dc.contributor.referee Kramer, Wilfried PD Dr. de
dc.date.examination 2005-11-01 de
dc.subject.dnb 570 Biowissenschaften, Biologie de
dc.description.abstracteng The Escherichia coli protein SurA which has been characterized as a periplasmic peptidyl-prolyl-isomerase (PPIase) and chaperon is involved in the maturation of trimeric outer membrane porins. The protein consists of three regions: the N-terminal region, two consecutive parvulin-like PPIase domains (PI and PII) and a short C-terminal sequence. The PPIase activity is located in the PII domain, the chaperon activity in the N- and C-terminal regions. SurA mutants show a destabilized outer membrane due to a decreased content of outer membrane proteins. In contrast to other molecular chaperons SurA binds its substrates selectively, but little is known about the molecular mechanism of this selectivity. To investigate the molecular basis of the interaction between SurA and its substrate, a peptide library representing natural substrates was screened for SurA binding peptides and binding segments were localized in the native structure of the substrates. Furthermore experiments were performed to identify the substrate binding regions on the surface of SurA. Cellulose bound peptide libraries of the native SurA substrates LamB, OmpF and OmpA were screened with SurA and SurAN+ICt which lacks the active PPIase domain PII. The interaction of SurA with a binding (# 46 from the LamB library) and non-binding peptide (# 71 from the LamB library) was analysed with surface plasmon resonance (SPR) and fluorescence spectroscopy to verify that the binding peptide has a significant higher affinity to SurA than the non-binding peptide. The affinity of peptide 46 to SurA was determined with a KD of 3 9 µM and the specificity of this binding was confirmed by fluorescence spectroscopic competition assays. Characteristic features of SurA binding peptides are i) specific patterns of aromatic amino acids Ar-x-Ar and Ar-Ar (with Ar = F, W, Y or H and x = any amino acid) with one further flanking aromatic amino acid in a distance of maximal seven amino acids and ii) the orientation of their aromatic side chains two side chains on one face and a further side chain ideally on the opposite face of the peptide. The simultanous occurence of both features is characteristic of integral outer membrane proteins and might therefore be crucial for selective substrate recognition and binding by SurA.The localisation of identified SurA binding peptides in the native structure of LamB and OmpF revealed numerous putative binding sites at the contact areas of the trimer subunits and only a few sites at membrane exposed trimer surfaces. Based on these findings, a mechanistically and energetically consistent working model was proposed, which for the first time and in accord with information already available on outer membrane proteins maturation and membrane insertion explains how SurA is released from the folding substrate. Another aim of this work was the identification of substrate binding sites in SurA by means of electron paramagnetic resonance using the before identified SurA binding peptides. By site specific mutagenesis single cysteins were introduced at three exposed sites in the SurA molecule. The spin label MTSSL was covalently attached at these cysteins via thiol coupling. The chaperon activity was neither influenced by these Cys substitutions nor by the MTSSL label at these positions. The mobility of the label was consistent with its predicted mobility in spin labelled SurA proteins that were generated by computational modelling of the known crystal structure. However, the mobility of the spin label was not altered in the presence of soluble SurA binding peptides. Therefore no information about the substrate binding site in SurA was obtained so far. de
dc.contributor.coReferee Schwienhorst, Andreas PD Dr. de
dc.subject.topic Mathematics and Computer Science de
dc.subject.ger Chaperon de
dc.subject.ger SurA de
dc.subject.ger <i>E. coli</i> de
dc.subject.ger Peptid-Bibliothek de
dc.subject.ger Porine de
dc.subject.ger Periplasma de
dc.subject.ger SPR de
dc.subject.ger EPR de
dc.subject.eng chaperone de
dc.subject.eng SurA de
dc.subject.eng <i>E. coli</i> de
dc.subject.eng peptid library de
dc.subject.eng porins de
dc.subject.eng periplasm de
dc.subject.eng SPR de
dc.subject.eng EPR de
dc.subject.bk 42 de
dc.identifier.urn urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-720-4 de
dc.identifier.purl webdoc-720 de
dc.affiliation.institute Biologische Fakultät inkl. Psychologie de
dc.subject.gokfull W de
dc.identifier.ppn 579210014 de

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