Zur Substratspezifität und Substratbindung des periplasmatischen Chaperons SurA aus <i>Escherichia coli</i>

Abstract

Das periplasmatische, als Peptidyl-Prolyl Isomerase (PPIase) und Chaperon charakterisierte Protein SurA aus Escherichia coli ist an der Reifung von trimeren Porinen der äußeren Membran beteiligt. Das Protein ist aus drei Regionen aufgebaut: der N-terminalen Region, zwei aufeinander-folgenden Parvulin-ähnlichen PPIase-Domänen (PI und PII) und einer kurzen C-terminalen Sequenz. Die PPIase-Aktivität ist in der PII-Domäne, die Chaperon-artige Aktivität in den N- und C-terminalen Regionen lokalisiert. Der surA-Phänotyp zeichnet sich durch eine destabilisierte äußere Membran aus, verursacht durch einen verringerten Gehalt an outer membrane proteins. Im Gegensatz zu anderen molekularen Chaperonen bindet SurA Substrate selektiv, so z.B. in vitro synthetisierte Porine der äußeren Membran. Zu dem molekularen Mechanismus dieser selektiven Substraterkennung ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit sollte die molekulare Basis der Interaktion zwischen SurA und seinen natürlichen Substraten nachgegangen werden. Dazu wurden zum einen Peptid-Bibliotheken natürlicher Substrate nach SurA-bindenden Peptiden durchmustert und bindende Abschnitte in die native Struktur der Substrate projiziert, zum anderen Experimente zur Lokalisation von Substrat-bindenden Bereichen auf der Oberfläche von SurA durchgeführt. Zellulose-gebundene Peptide-Bibliotheken der nativen SurA-Substrate LamB, OmpF und OmpA wurden mit Wildtyp-SurA bzw. mit SurAN+ICt, einer SurA-Variante, der die aktive PPIase-Domäne PII fehlt, auf Bindung durchmustert. Mittels surface plasmon resonance (SPR) und Fluoreszenzspektroskopie wurde bestätigt, dass ein SurA-bindendes Peptid (Peptid 46 der LamB-Bibliothek) mit signifikant höherer Affinität an SurA bindet als ein nicht bindendes Peptid (Peptid 71 der LamB-Bibliothek). Die Affinität des Peptides 46 für SurA wurde mit einer KD von 3 9 µM bestimmt und die Spezifität dieser Bindung durch fluoreszenzspektroskopische Kompetitionsstudien verifiziert. Als charakteristische Merkmale SurA-bindender Peptide wurden (i) spezifische Muster aromatischer Aminosäuren Ar-x-Ar und Ar-Ar (mit Ar = F, W, Y oder H und x = beliebige Aminosäure) mit einer weiteren, flankierenden aromatischen Aminosäure im Abstand von maximal sieben Aminosäuren sowie (ii) die Ausrichtung ihrer aromatischen Seitenketten zwei Seitenketten auf der gleichen und idealerweise eine weitere Seitenkette auf der gleichen oder gegenüberliegenden Seite des Peptides identifiziert. Das gemeinsame Auftreten beider Merkmale ist charakteristisch für integrale Proteine der äußeren Membran und kann daher als entscheidendes Kriterium der selektiven Substraterkennung und -bindung durch SurA gewertet werden.Die Lokalisierung identifizierter, SurA-bindener Peptide in den nativen Strukturen der Proteine LamB und OmpF zeigte, dass zahlreiche putative Bindestellen in den Trimer-Kontaktflächen, jedoch nur wenige in den Membran-exponierten Bereichen der Trimere liegen. Im Einklang mit bisherigen Erkenntnissen zur Reifung und Membraninsertion der Proteine der äußeren Membran konnte auf Basis einer derartigen Besetzung der Porin-Faltungsintermediate durch SurA erstmals ein mechanistisch und energetisch schlüssiges Arbeitsmodel zur Rolle von SurA in diesen Prozessen aufgestellt werden. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Identifizierung einer Substratbindestelle in SurA mittels electron paramagnetic resonance unter Verwendung zuvor identifizierter SurA-bindender Peptide. Durch ortspezifische Mutagenese wurden Cysteine in verschiedenen, exponierten Positionen des SurA-Moleküls eingebracht und über Thiolkopplung kovalent mit der Radikalsonde MTTSL verknüpft. Auf diese Weise konnten MTSSL-Sonden an drei Positionen des SurA-Moleküls immobilisiert werden. Die Chaperon-artige Aktivität des SurA-Proteins blieb durch die Cys-Substitutionen und die MTSSL-Sonde in diesen Positionen unbeeinflusst. Der aus den EPR-Spektren hervorgehende Immobilisierungsgrad der Sonden war im Einklang mit der bekannten SurA-Kristallstruktur. Jedoch war in Anwesenheit löslicher, SurA-bindender Peptide keine verminderte Mobilität der Sonden erkennbar, so dass bisher keine Hinweise auf den Ort der Substratbindung in SurA gewonnen werden konnten.