Zur Struktur und Funktion regulatorischer Elemente des cbb-Regulons in Ralstonia eutropha

Abstract

Für die autotrophe Assimilation von CO2 benötigt Ralstonia eutropha H16 die Enzyme des Calvin-Cyclus. Die genetische Kontrolle bei der wechselseitigen Umstellung des Kohlenstoffmetabolismus zwischen autotrophen und heterotrophen Bedingungen betrifft vorrangig die Transkription der cbb-Operone, deren Expression primär über den Transkriptionsaktivator CbbR kontrolliert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die z.T. bereits identifizierten regulatorischen Komponenten des cbb-Systems von R. eutropha H16 in ihrer Funktionsweise eingehend charakterisiert, und weitere potentielle Regulatoren/Modulatoren identifiziert, die zusammen mit CbbR an der Kontrolle der cbb-Operone beteiligt sein könnten. Ortsspezifische Mutagenesen und Aktivitätsmessungen ergaben eine Verifizierung des cbb-Operonpromotors PcbbL als typischen σ70-abhängigen Promotor und eine nahezu konstitutive Aktivität des Regulatorgenpromotors PcbbR auf sehr niedrigem Niveau. Anhand von Studien mit den PcbbL-Mutanten konnte gezeigt werden, daß auch im CbbR-freien Hintergrund einer entsprechenden cbbR-Deletionsmutante das generelle Regulationsmuster des cbb-Systems prinzipiell erhalten blieb, wenn auch auf sehr niedrigem Niveau. In diesem Zusammenhang deuteten DNA-Bindungsstudien und bereits zuvor durchgeführte In vitro-Transkriptionsstudien auf die Existenz mindestens eines weiteren in der cbb-Regulation involvierten Regulators hin. Gelretardationsexperimente mit der cbb-Kontrollregion führten zur Detektion zweier Proteine, P1 und P2, deren neben CbbR ebenfalls spezifische Bindung an die cbb-Kontrollregion nachgewiesen wurde. P2 wurde in der Folge als ein Ortholog von PhcA aus Ralstonia solanacearum identifiziert, das in diesem Organismus als übergeordneter Regulator fungiert. Parallele Untersuchungen einer autotroph negativen cbbR-Deletionsmutante hatten zuvor ergeben, daß die bei einer Revertante aufgetretene Spontanmutation in phcA eine Suppression der cbbR-Deletion bewirkte. Im Wildtyp wies PhcA hingegen keine Funktion bei der Regulation der cbb-Operone auf, schien jedoch für R. eutropha eine wichtige Rolle für die Überlebensfähigkeit unter Stressbedingungen zu spielen. Der zweite potentielle Regulator, P1 wurde bis zur apparenten Homogenität angereichert. Durch Kompetionsexperimente konnte die P1-Bindungsregion unmittelbar upstream der CbbR-Bindungsregion identifiziert werden. Bindungsstudien und Promotoraktivitätsmessungen mit Subfragenten der P1-Bindungsregion deuteten auf eine wichtige modulatorische Funktion dieses Proteins bei der Transkriptionsaktivierung von PcbbL hin. Bei gleichzeitiger Bindung von CbbR und P1 innerhalb der Operator/Promotorregion wurde nachgewiesen, daß die zusätzliche Bindung von P1 eine deutliche Abschwächung der durch CbbR induzierten DNA-Krümmung hervorruf. Diese Funktion von P1 könnte daher einen wichtigen Mechanismus für eine effiziente Aktivierung der cbb-Operone darstellen. Zur Bestimmung der Funktionsweise des Signalmetaboliten Phosphoenolpyruvat (PEP) bei der cbb Regulation wurden DNA-Bindungsstudien und Aktivitätsmessungen von PcbbL in E. coli durchgeführt. Die durch PEP verursachte Repression der cbb-Operone konnte auf eine erhöhte Bindungsaffinität von CbbR an den Operator in Gegenwart des Metaboliten zurückgeführt werden. Anhand der vorliegenden Ergebnisse wird der intrazelluläre PEP-Spiegel als wichtige Regelgröße aus dem zentralen Kohlenstoffmetabolismus für die Kontrolle des cbb-Systems betrachtet. Die essentielle Funktion von CbbR für das System scheint weniger in der eines einseitigen Aktivators, als eher in der eines zentralen Integrators zu liegen, der die verschiedenen zur Aktivierung von PcbbL benötigten Signale umsetzt.